La construcción de un hidrogel de colágeno para la entrega de la madre microesferas cargadas con células quitosano

Este protocolo ofrece una estrategia in vitro para entregar células madre a partir de microesferas de quitosano en un andamiaje de gel de colágeno, cosechar y cultivar. Las células madre adipocíticas primarias luego emulsionan y recuperan una preparación de microesferas de quitosano. A continuación, siembre las células madre en las microesferas de quitosano y cúltívelas en una placa de cultivo con inserto de membrana de ocho micrones de tamaño de poro para producir finalmente un sistema de entrega de microesferas cargado con CS, que se mezcla con un andamiaje tridimensional de gel de colágeno.

En última instancia, este sistema CSM ofrece un potencial para su uso en medicina regenerativa y en la administración de fármacos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inyección celular o la microencapsulación es la capacidad de las células para adherirse a un material portador y persistir tras la aplicación inicial. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las microesferas esan poseen una carga estática inherente.

Y cargar las células sobre un lecho de microesferas será difícil sin perturbarlas. Excise y lave el tejido adiposo perineal y epidérmico de una muestra triturada, luego mince el tejido y transfiera de uno a dos gramos a 25 mililitros de HBSS que contenga 1% de FBS. Después de la centrifugación, recoja la capa de tejido adiposo que flota libremente en un matraz erlenmeyer de 125 mililitros.

Añada 25 mililitros de colagenasa tipo dos e incube la reacción en un agitador orbital. Ahora retire cuidadosamente la fracción líquida debajo de la capa de aceite y tejido adiposo y filtre sucesivamente a través de filtros de malla de nailon de 170 micrones. Recupere las células por centrifugación tras dos lavados con 25 mililitros.

HBSS Resus, suspender el precipitado en 30 mililitros de medio de crecimiento Mesen Pro suplementado. Dividir las células madre derivadas del tejido adiposo purificadas en dos frascos de cultivo T 75 y amplificar la preparación de CMA en un incubador humedecido con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius. Este protocolo de CSM es un proceso de emulsificación de agua en aceite que utiliza una técnica iónica coer.

Emulsione seis mililitros de una solución acuosa de quitosano en 100 mililitros de una mezcla de fase oleosa utilizando agitación magnética y agitación mecánica simultáneas en direcciones opuestas durante una hora hasta obtener una emulsión estable de agua y aceite; añada 1,5 mililitros de hidróxido de potasio al 1 % en n-octano cada 15 minutos durante cuatro horas. Tras finalizar la reacción de reticulación iónica, vierta lentamente la fase oleosa y añada inmediatamente las esferas a 100 mililitros de acetona. Lave las esferas con acetona hasta eliminar completamente la fase oleosa.

Luego, seque las esferas recuperadas al vacío. Desicque y determine el tamaño promedio de las partículas de CSM, el área superficial por miligramo y el volumen cúbico unitario utilizando un analizador de tamaño de partículas. Proceda a lavar el CSM tres veces con agua estéril para eliminar las sales residuales.

Ahora esterilice la preparación de CSM con alcohol absoluto para su uso en experimentos celulares en un tubo de vidrio de 50 mililitros, mezcle cinco miligramos de microesferas con un mililitro de solución de 0,5 % TNBS e incube durante cuatro horas a 40 grados Celsius. Luego agregue tres mililitros de ácido clorhídrico 6 N e incube a 60 grados Celsius durante dos horas. Después de enfriar las muestras a temperatura ambiente, añada cinco mililitros de agua desionizada y 10 mililitros de éter etílico.

Para extraer el TNBS libre, retire una alícuota de cinco mililitros de la fase acuosa y caliente a 40 grados Celsius en un baño de agua durante 15 minutos para evaporar cualquier éter residual tras enfriar a temperatura ambiente. Diluya con 15 mililitros de agua y mida la absorbancia de las microesferas de quitosano preparadas a 345 nanómetros utilizando TNBS como blanco en un espectrofotómetro.

También mida la cantidad de quitosano utilizada para la preparación del CSM. Ahora, calcule el número de grupos amino libres del CSM en relación con el número total de grupos amino en el quitosano. Equilibre cinco miligramos del CSM esterilizado en HBSS estéril durante la noche.

Transfiera el CSM a un inserto de membrana de ocho micrómetros para placas de cultivo de 24 pocillos. Después de que el CSM se haya sedimentado, aspire cuidadosamente el HBSS. A continuación, agregue 300 microlitros de medio de crecimiento al interior del inserto y 700 microlitros de medio de crecimiento al exterior del inserto. Resus.

Suspenda las células madre derivadas del tejido adiposo en 200 microlitros de medio de crecimiento y siembre sobre la MTC dentro de la placa de cultivo. Incube durante 24 horas en un incubador humedecido con dióxido de carbono al 5 % a 37 grados Celsius. Transfiera la MTC cargada con CMA a un tubo estéril de microcentrífuga sin perturbar las células que han migrado hacia la membrana del inserto.

Ahora retire el medio residual y agregue 250 microlitros de medio de crecimiento fresco a cada tubo. Agregue 25 microlitros de solución de MTT a cinco miligramos por mililitro e incube durante cuatro horas. Retire los medios y agregue 250 microlitros de dimetilsulfóxido; vortexee para solubilizar el complejo formazán. Centrifugue el CSM a 2.700 ×g durante cinco minutos.

Mida la absorbancia del sobrenadante a 570 nanómetros utilizando 630 nanómetros como referencia. Proceda a determinar el número de células asociado al CSM en relación con el valor de absorbancia obtenido a partir de números conocidos de A SC viables. Mezcle cinco miligramos de un CSM cargado con SC con 7,5 miligramos por mililitro. Colágeno tipo uno extraído de rata.

Tendón de la cola, ajuste el pH a 6,8 utilizando hidróxido de sodio normal dos veces y vierta en una placa de cultivo. Inserte para fibrilar y luego transfiera a una placa de 12 pocillos e incube durante 30 minutos. Continúe renovando el medio para los geles de colágeno A-S-C-C-S-M cada dos días durante el período de incubación.

También supervise, libere y observe la migración de células desde las MRC hacia el gel utilizando técnicas estándar de microscopía. Este ejemplo siguiente describe la estrategia in vitro para entregar células madre derivadas del tejido adiposo desde microesferas de quitosano hacia un andamio de gel de colágeno. Las imágenes de MEB y MET indican una preparación de MRC porosas de tamaño uniforme.

La incubación de las microesferas con células madre derivadas del tejido adiposo primarias indica 4.000 células por miligramo de CSM de calcio am. La tinción de un SC muestra la diseminación sobre el CSM con prolongación de filopodios hacia las hendiduras porosas de la microesfera. Cuando los CSM cargados con células se mezclaron con el gel de colágeno, las células migraron hacia el gel y pudieron seguirse a lo largo del tiempo.

Las implicaciones de esta técnica se extienden inmediatamente hacia la terapia de la pérdida masiva y crónica de tejidos. Sin embargo, este régimen de tratamiento tiene un potencial mucho mayor debido a su versatilidad para integrarse con una variedad de células y/o biomateriales utilizados para tratar diferentes grados de pérdida de tejidos blandos y cardíacos. Duda que este método pueda proporcionar información sobre la administración de células huésped.

También puede aplicarse a otros sistemas, como inyectables, para administrar fármacos terapéuticos, y para desarrollar sistemas híbridos que permitan entregar simultáneamente células y fármacos terapéuticos.