Multiplex detección de bacterias en el complejo de muestras clínicas y ambientales utilizando oligonucleótidos de acoplamiento de microesferas fluorescentes
23 de octubre de 2011
Se describe un método multiplex para la detección de microorganismos en una muestra utilizando oligonucleótidos junto perlas fluorescentes. Amplificación de todos los organismos dentro de una muestra se hibridó con un panel de cuentas, junto sonda. Un instrumento Luminex o Bio-Plex se utiliza para consultar cada cuenta para el tipo de cuentas y la señal de hibridación.
Hola, soy Tim Duso de Agricultura y Agroalimentación Canadá. En este video, demostraremos un protocolo para determinar la presencia y abundancia de microorganismos específicos en una muestra clínica o ambiental compleja utilizando un instrumento bio plex. Este protocolo emplea perlas de poliestireno fluorescentes que están acopladas químicamente a una sonda de oligonucleótidos específica para la especie.
Se genera un amplicón a partir de la muestra utilizando cebadores universales de PCR y el amplicón se hibrida con perlas acopladas a sondas. Se generan dos señales con el instrumento Bio-Plex: una identifica la perla y la otra cuantifica la señal de hibridación.
El objetivo general del procedimiento es determinar un perfil de la microbiota de interés de manera rápida y semicuantitativa. Hemos aplicado esta técnica para determinar perfiles bacterianos en hisopados vaginales y utilizar los datos generados para diagnosticar la vaginosis bacteriana, una afección clínica que se caracteriza por un cambio en la microbiota en la cual los organismos del género Lactobacillus se vuelven menos prevalentes y otros organismos como Gardnerella, Vais y Apoian vae se vuelven detectables en hisopados vaginales. Es importante tener en cuenta, sin embargo, que esta técnica puede aplicarse a cualquier otra microbiota para la cual sea deseable un ensayo multiplex rápido.
Comencemos describiendo cómo funciona el procedimiento. Se genera un perfil microbiano amplificando una proteína y el gen de la chaperona 60 de todos los organismos presentes en un extracto de ADN del hisopo. Uno de los cebadores de amplificación universal se modifica mediante la adición de biotina, así como con la inclusión de bases modificadas con fosfato.
En el extremo cinco prima, el amplicón se hace monocatenario utilizando la exonucleasa T siete, que degrada únicamente la cadena antisentido. Dado que la cadena sentid o está protegida por un cebador de PCR modificado con fosfato, las sondas de oligonucleótidos complementarias a la cadena restante se acoplan covalentemente a perlas de poliestireno fluorescentes. Como cada color único de perla contiene una sonda que detecta un organismo diferente, se pueden utilizar hasta cien perlas distintas para una sola muestra.
El producto de PCR de cadena sencilla procedente del hisopo vaginal se hibrida con una mezcla de perlas acopladas a sondas que contienen sondas para todos los organismos de interés. Se añade un marcador fluorescente FICO etín que se une a las sondas biotiniladas mediante un conjugado de estreptavidina. Finalmente, la mezcla de hibridación se analiza en un instrumento Luminex o Bio-Plex, que examina individualmente cada perla para determinar su identidad y la señal de hibridación.
Los resultados de este análisis indican la presencia de microorganismos específicos y la intensidad de la señal de hibridación se correlaciona con la abundancia de ese organismo. En la muestra, la presencia de organismos relacionados con la vaginosis bacteriana puede utilizarse para diagnosticar la BV. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la tinción de Gram es que se obtiene información sobre la presencia de microorganismos específicos y su abundancia.
La procedura será demostrada por Jennifer Town, una asistente de investigación en nuestro laboratorio. Re suspenda las microesferas mediante vortex durante aproximadamente 20 segundos. Transfiera 400 microlitros de microesferas a un tubo centrífugo eppendorf y centrifugue a 14.000 ×g durante un minuto, retire y deseche el sobrenadante. Suspenda las microesferas en 50 microlitros de MES 0,1 molar pH 4,5.
Agregue un animo de oligo de captura a las microesferas y mezcle por vórtex. Agregue 2.5 microlitros de solución fresca de EDC a las microesferas. Incube la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad.
Deseche la solución de EDC que se preparó anteriormente y prepare una muestra fresca de 10 miligramos por mililitro de EDC en agua. Como se indicó antes, agregue otros 2,5 microlitros de la solución fresca de EDC a las microesferas y vortexee durante cinco segundos. Incube nuevamente a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad.
Lave las perlas añadiendo un mililitro de Tween 20 al 0,02 %, vortexee para resuspender las perlas y centrifugue a 14.000 ×g durante un minuto; retire y deseche el sobrenadante. Vuelva a lavar las perlas añadiendo un mililitro de SDS al 0,1 %. Resuspenda las perlas en 100 microlitros de tampón TE.
Contar las microesferas en un hemocitómetro para determinar la concentración del stock. Prepare una mezcla maestra de microesferas diluyendo cada microesfera hasta una concentración final de 100 microesferas por microlitro en el tampón TE. Agrupe las microesferas acopladas según el plex deseado del ensayo. Almacene la mezcla maestra de microesferas a cuatro grados en la oscuridad. Esta mezcla puede almacenarse durante meses si se mantiene bajo estas condiciones. Genere el producto de PCR para cada muestra.
Incluya inmediatamente el conjunto de cebadores modificados con fosfato y biotina en el extremo cinco primo justo después de finalizar la PCR. Añada dos microlitros de exonucleasa T7 a cada tubo de PCR e incube a temperatura ambiente durante 40 minutos. Al final de esta incubación, añada 12,5 microlitros de E-D-T-A 0,5 M, pH 8,0, y mezcle.
Esto proporciona un total de aproximadamente 64,5 microlitros de producto de PCR de cadena sencilla. Resuspenda la mezcla maestra de microesferas mediante una pipeta. Dispense una cantidad adecuada en un tubo einor.
Cierre el tubo y sonicar durante dos minutos en un baño ultrasónico con agua. Dispense 17 microlitros de producto de PCR de cadena sencilla en los pocillos correspondientes de una placa de 96 pocillos de perfil bajo y agregue 33 microlitros de la mezcla de perlas resuspendidas y sonicadas a cada uno.
Cubriremos la placa con una tapa de silicona y golpearemos suavemente. Coloque cuidadosamente la placa en el termociclador con un programa de 95 grados durante cinco minutos, 60 grados durante 10 minutos, mantenimiento o pausa a 60 grados durante cinco minutos. Fin, inicie el programa.
Prepare una solución fresca de strep Aden FICO Ethin. Necesitará 25 microlitros por pocillo. Prepare strep y FICO ethin diluyendo el tallo a un miligramo por mililitro.
Uno de 50 a 20 microgramos por mililitro con tampón TMAC al 1×. Cuando el termociclador llegue al paso de mantenimiento a 60 grados, abra la tapa, retire la cubierta de silicona y agregue la solución de estreptavidina-FICO directamente a cada pozo. Vuelva a colocar la cubierta de silicona, cierre la tapa del termociclador y reanude el programa.
Cuando el programa haya finalizado, retire la placa y transfiérala rápidamente al equipo Bio Plex para su lectura. La placa debe leerse dentro de los 10 minutos. Lea la placa a 60 grados.
Asegúrese de que el BioPlex se haya precalentado a esta temperatura. Esto muestra los resultados de las tinciones de Gram y los perfiles Luminex correspondientes de muestras longitudinales de un individuo único en el tiempo cero. La tinción de Gram es consistente con un diagnóstico clínico de vaginosis bacteriana (VB), y esto se corrobora mediante un ensayo Luminex Fiveplex que muestra señales positivas de hibridación para organismos asociados con VB, incluyendo Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae y Veillonella.
Lactobacillus iners también se detecta en niveles bajos a medida que avanza el tiempo. Este individuo transita de una microbiota asociada a vaginosis bacteriana (BV) a una microbiota normal, como se observa mediante tinciones de Gram. El análisis mediante Luminex de estas mismas muestras muestra que la abundancia de Gardnerella vaginalis alcanza un pico y luego disminuye, mientras que Lactobacillus iners aumenta hasta convertirse en el organismo predominante en el último punto temporal.
Al utilizar este método para el perfilado de la microbiota, se genera información sobre la presencia de organismos específicos, así como sobre su abundancia. Dado que el método se basa en secuencias, el diseño de sondas puede basarse en análisis de secuenciación profunda, y los microorganismos identificados mediante métodos de secuenciación de nueva generación pueden rastrearse en muestras de manera rápida y con un costo relativamente bajo. Ver este video debería haberle proporcionado una buena comprensión de cómo generar un perfil microbiano a partir de una muestra utilizando un instrumento Luminex o Bio Plex.
Le hemos mostrado cómo acoplar sondas de oligonucleótidos a las perlas fluorescentes, generar una alicona de cadena sencilla a partir de una muestra clínica o ambiental, realizar la hibridación y determinar los resultados en un instrumento Luminex o Bio Plex. Buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para detectar microorganismos en muestras complejas utilizando perlas fluorescentes acopladas a oligonucleótidos. El método emplea un instrumento Bio-Plex para analizar las señales de hibridación provenientes de las perlas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Diagnóstico clínico
- Ciencia ambiental
Antecedentes
- La detección de microorganismos es fundamental en diversos campos.
- Los métodos tradicionales pueden ser lentos y menos específicos.
- Este método mejora la especificidad y la sensibilidad.
- Las microesferas fluorescentes permiten capacidades de multiplexación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rápido y eficiente para la detección de microorganismos.
- Utilizar sondas de oligonucleótidos para lograr especificidad.
- Mostrar la aplicación del instrumento Bio-Plex en este contexto.
Métodos Utilizados
- Uso de microesferas de poliestireno fluorescentes acopladas a sondas específicas de especie.
- Generación de amplicones mediante cebadores universales de PCR.
- Hibridación de amplicones a microesferas acopladas a sondas.
- Análisis del tipo de microesfera y de la señal de hibridación mediante un instrumento Bio-Plex.
Resultados principales
- Detección exitosa de múltiples microorganismos en un solo ensayo.
- Se demostró la cuantificación de las señales de hibridación.
- Protocolo validado para muestras clínicas y ambientales.
- Se logró alta especificidad y sensibilidad con el método.
Conclusiones
- El método multiplex es efectivo para la detección de microorganismos.
- La utilización de sondas de oligonucleótidos mejora la especificidad.
- El instrumento Bio-Plex es una herramienta valiosa para este análisis.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección múltiple mediante microesferas fluorescentes acopladas a oligonucleótidos permite un perfilado rápido y semicuantitativo de comunidades microbianas complejas en muestras clínicas y ambientales. Este enfoque mejora la confianza predictiva en los diagnósticos microbianos al proporcionar resolución a nivel de especie y datos de abundancia, apoyando puntos críticos de inflexión en la investigación traslacional y el desarrollo de ensayos. Su escalabilidad y adaptabilidad lo posicionan como una plataforma reutilizable para la vigilancia microbiana generalizada y la validación de dianas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar los cambios en la comunidad microbiana relacionados con los mecanismos de enfermedad y la verificación de hipótesis terapéuticas.
- Apoya la validación funcional de objetivos mediante la cuantificación de la abundancia de organismos específicos en muestras complejas.
- Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante la detección de alta especificidad de taxones clínicamente relevantes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara sistemas de detección validados y multiplexados para flujos de trabajo diagnósticos y de cribado posteriores.
- Proporciona perfiles microbianos estandarizados, reproducibles y semicuantitativos para la evaluación de ensayos.
- Permite una ampliación escalable para detectar hasta 100 organismos por muestra, lo que favorece la reutilización de la plataforma.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Se alinea con estrategias traslacionales de biomarcadores mediante el seguimiento longitudinal de los cambios microbianos asociados a la enfermedad.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir un diseño rápido de sondas basado en secuencias.
- Reduce la ambigüedad mecanicista en los modelos de enfermedad al proporcionar datos de abundancia específicos para cada organismo.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Esta plataforma multiplex integra desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de fármacos y la investigación traslacional, apoyando el perfilado microbiano basado en hipótesis y la preparación de ensayos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis y la aclaración de vías mediante el perfilado de la composición y abundancia de la microbiota.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos reproducibles para comparaciones fiables entre muestras y condiciones.
- Análisis: Ofrece la intensidad de la señal de hibridación como lectura cuantitativa de la abundancia de organismos.
- Investigación Traducional: Permite el seguimiento longitudinal de biomarcadores microbianos relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a diversos tipos de muestras y objetivos microbianos, lo que favorece una amplia utilidad en I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y la validación de objetivos al permitir la detección a nivel de especie en muestras complejas.
- Valor operativo: Estandariza y escala el perfilado microbiano multiplex para aplicaciones de alto rendimiento.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y reduce el riesgo en fases tardías al proporcionar datos microbianos accionables.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de programas diagnósticos y terapéuticos dirigidos a condiciones asociadas al microbioma.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el diseño de sondas moleculares y en protocolos basados en PCR.
- Necesita acceso a instrumentación Luminex o Bio-Plex y a infraestructura analítica.
- Exige estandarización entre equipos de conjuntos de sondas y condiciones de ensayo para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a diversos tipos de muestras clínicas y ambientales con una personalización adecuada de las sondas.
- Limitado por la necesidad de información de secuencias para orientar el diseño de las sondas y por la posibilidad de reactividad cruzada en comunidades altamente diversas.
