La detección de bacterias mediante ADNzimas fluorogénicos

El objetivo general del siguiente experimento consiste en detectar rápidamente la presencia de bacterias específicas, como e coli, mediante el uso de novedosas sondas flu génicas de ADN, Zyme. En primer lugar, se generan sondas génicas completas de ADN mediante ligación. A continuación, se cultivan bacterias para enriquecer el número de moléculas diana y se prepara una mezcla extracelular acumulada a partir del sobrenadante.

La mezcla extracelular cruda se combina entonces con la sonda de ADNzima; la interacción entre la sonda de ADNzima y las moléculas diana provoca la escisión de la sonda, lo que hace que esta fluoresca. Se utiliza un fluorímetro, y la interacción entre la sonda y el blanco se observa como un aumento en la fluorescencia relativa. Los resultados se verifican posteriormente mediante análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos basados en PCR o en anticuerpos es que el procedimiento es más sencillo y fácil de realizar. Aunque este método ha sido desarrollado utilizando la bacteria modelo Escherichia coli, puede aplicarse a la detección de cualquier otro patógeno bacteriano transmitido por alimentos o de origen nosocomial. En general, las personas nuevas en este método podrían tener dificultades porque quizás no estén acostumbradas al manejo de sondas de ADN sintéticas y de bacterias. El procedimiento lo demuestran Sergio Aguirre, ayudante de investigación de mi laboratorio, y Monso Ali, investigador posdoctoral, para este protocolo.

R-F-D-E-C uno es el ADNzima destacado. Consiste en la secuencia catalítica EC uno subrayada en negro y la secuencia sustrato FS uno subrayada en verde; dentro del sustrato se encuentra un enlace de ARN indicado por la r azul flanqueada por una DT marcada con un fluoróforo indicada por la F y una DT marcada con un apagador indicada por la Q. RF SS uno es una versión desordenada de R-F-D-E-C uno, en la que la secuencia catalítica EC uno se reorganiza parcialmente en SS uno, pero la porción FS uno permanece sin cambios. RF DEC uno y RF SS uno se sintetizan mediante la ligación enzimática mediada por plantilla del oligonucleótido FS uno con el oligonucleótido EC uno o SS uno en presencia de LT uno como plantilla de ligación, para preparar mezclas extracelulares crudas o cems que se utilizarán como blanco para R-F-D-E-C uno. Comience dispensando dos mililitros de LB en tubos de cultivo estériles de 14 mililitros usando una pipeta automática.

A continuación, utilizando la punta estéril de una pipeta, seleccione una colonia individual de E. coli de una placa de agar y colóquela en un tubo de cultivo que contenga LB. Coloque los tubos en un incubador ajustado a 37 grados Celsius y agite a 250 rpm durante 14 horas tras la incubación. Para obtener un cultivo de re-inoculación al 1 %, dispense dos mililitros de LB fresco en tubos de cultivo de 14 mililitros y añada 20 microlitros del cultivo bacteriano del paso anterior.

Incube los tubos a 37 grados Celsius con agitación a 250 RPM hasta que cada solución bacteriana alcance una DO 600 de aproximadamente uno. Transfiera un mililitro de cada cultivo a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y haga un pellet de las células mediante centrifugación a 11.000 G durante cinco minutos. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante claro a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros nuevo.

Almacene el sobrenadante a menos 20 grados Celsius. Si no se va a utilizar inmediatamente para determinar si se genera una señal fluorescente con la interacción de las enzimas de ADN con el extracto celular crudo, las muestras se analizan mediante espectrofotometría. Encienda el espectrofotómetro de fluorescencia y configure los parámetros de adquisición de datos con una excitación a 488 nanómetros y una emisión a 520 nanómetros.

Además, configure el instrumento para tomar lecturas cada minuto durante una hora. Lave tres cubetas de cuarzo primero con agua desionizada destilada y luego con etanol al 100 %. Seque las cubetas pasando gas nitrógeno.

Etiquete las cubetas como C uno para el control uno, C dos para el control dos y T para la prueba. A continuación, transfiera 24 microlitros de agua destilada desionizada a C uno y 24 microlitros de la mezcla extracelular cruda de e coli preparada a C dos y a T. Añada 25 microlitros de dos X RB a cada cubeta y colóquelas en el espectrofotómetro de fluorescencia. Comience a recopilar los datos de fluorescencia después de cinco minutos; añada un microlitro de RFS S uno de cinco micromolar a C dos y un microlitro de RFD eec uno de cinco micromolar a T y a C uno, asegurándose de que las lecturas de fluorescencia no se interrumpan. Mezcle cada solución mediante pipeteo y luego permita que la reacción continúe durante el resto del periodo de adquisición.

Guarde los datos en formato de archivo de Excel. Luego transfiera los datos a una computadora personal y utilice Excel para crear una imagen gráfica. Las mismas mezclas de reacción que se utilizaron para el análisis mediante Spectra.

La fotometría puede utilizarse para el análisis mediante electroforesis en gel. Después de una hora de adquisición, retire las cubetas del espectrofotómetro y transfiera las soluciones a nuevos tubos microcentrífugos.

Detenga las reacciones añadiendo cinco microlitros de acetato de sodio tres molar y 125 microlitros de etanol al 100 %. Mezcle cada solución mediante vortex y coloque los tubos en el congelador a menos veinte grados Celsius durante una hora tras la centrifugación de incubación. Centrifugue las mezclas de reacción a 11.000 G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius y retire cuidadosamente el sobrenadante por pipeteo.

Seque las pastillas utilizando un concentrador de ADN durante 10 minutos. Añada 20 microlitros de tampón de carga para gel y vortexe brevemente. Centrifugue brevemente con una centrífuga de banco.

A continuación, cargue 10 microlitros de las muestras de reacción por pocillo en un gel de Dage al 10% después de la corrida. Retire las placas de vidrio y lávese bien con agua corriente. Para eliminar cualquier resto de gel, limpie las placas con una toallita Kim.

Analice la placa de gel en busca de fluorescencia utilizando un escáner Typhoon. Analice las imágenes resultantes mediante software de cuantificación de imágenes para evaluar la sensibilidad del sistema. Se cultivan diluciones seriadas durante períodos de tiempo crecientes.

Para determinar el período mínimo de incubación necesario para detectar una sola bacteria, prepare 10 tubos de cultivo que contengan dos mililitros de LB, inocule cada cultivo con 100 microlitros de dos UFC por mililitro de un stock de glicerol de E. coli e incube a 37 grados Celsius con agitación a 250 RPM a las 4, 8, 12, 16 y 24 horas. Recoleccione 300 microlitros de cada uno de los tubos de cultivo inoculados, ya que podría no haber bacterias detectables en las muestras recolectadas en los puntos de tiempo 4, 8 y 12.

Deje que el cultivo restante crezca durante 24 horas para identificar los cultivos que contienen bacterias. Mida la DO 600 y precipite las células mediante centrifugación a 11.000 G durante cinco minutos. Transfiera el sobrenadante, que contiene los CEMS, a tubos microcentrífugos nuevos de 1,5 mililitros y almacénelos a menos 20 grados Celsius hasta su uso al día siguiente.

Inspeccione los cultivos en busca de crecimiento. Solo uno o dos de los 10 cultivos pueden contener E. coli tras la inoculación, y los tubos restantes no contendrán ninguna célula. Utilice los CEMS recuperados de los cultivos positivos en los puntos de tiempo designados para preparar reacciones de escisión con RFD EEC uno, analice las mezclas de reacción mediante electroforesis en gel DAGE como se describió anteriormente; tanto las sondas RFD EEC uno como RF SS uno se prepararon mediante la ligación enzimática de las porciones de DNAzima al sustrato.

Una interacción FS entre CEM EEC y RFD EEC uno o RF SS uno se evaluó entonces mediante espectrometría. Como puede observarse aquí, R-F-D-E-C uno produjo un alto nivel de señal fluorescente tras la adición de CEM ec.

En marcado contraste, R FS S uno no produjo una señal fluorescente intensa. Por lo tanto, la función productora de fluorescencia de RFD EEC uno. Tras ponerse en contacto con CEM EC se secuencia.

Específico para verificar que los aumentos de fluorescencia observados se debieron a la escisión del enlace de ARN. Las mezclas de reacción se analizaron mediante escisión en gel de RFD eec, una por hidróxido de sodio 0,25 molar se espera que genere fragmentos de ADN 2D, un fragmento en cinco primas que retiene el fluoróforo y un fragmento en tres primas que retiene el apagador. Como puede observarse aquí.

La mezcla de reacción RFD EEC CEM EEC produjo efectivamente el producto de escisión esperado. Además, solo UNC escindió R-F-D-E-C uno, y el fragmento cinco-prima pudo detectarse mediante imágenes de fluorescencia. Para examinar la especificidad de RFD EEC uno, se realizaron ensayos de fluorescencia utilizando CEMS recolectados exclusivamente de varias otras bacterias gram-negativas y gram-positivas.

La muestra que contenía CEM EC produjo un aumento en la fluorescencia. La ausencia de reactividad cruzada con CEMS de otras bacterias indica que R-F-D-E-C uno es altamente selectivo para e coli para determinar el tiempo mínimo de cultivo necesario para detectar una sola célula de e coli. e coli diluido a una UFC por mililitro en 100 microlitros se cultivó con medio de crecimiento durante 4, 8, 12, 16 y 24 horas. Los CEMS resultantes se mezclaron con R-F-D-E-C uno y el corte se evaluó mediante dage, como se muestra aquí.

Una imagen del ensayo Dage indica que R-F-D-E-C no produjo el producto de escisión esperado. Cuando reaccionó con CEM, se recogió ECS a las cuatro y ocho horas de crecimiento, lo que indica que se necesita un tiempo de cultivo de 12 horas una vez dominado.

El componente clave de esta técnica es que el ensayo basado en enzimas DA puede realizarse en 60 minutos si se lleva a cabo correctamente después de este desarrollo. El procedimiento allanó el camino para que los investigadores en el campo del análisis biológico exploraran enzimas de ADN alogénico para la detección de una amplia gama de patógenos bacterianos.