Formulación de nanopartículas poliméricas mediante la técnica de dibloque Nanoprecipitation

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar nanopartículas poliméricas utilizando un método de nanoprecipitación. Esto se logra primero realizando una reacción E-D-C-N-H-S para generar el copolímero A-P-L-G-A PEG. Luego, el copolímero PLGA PEG se utiliza para generar nanopartículas, encapsulando el fármaco o carga de interés mediante nanoprecipitación.

En este momento, se puede realizar la caracterización biofísica básica, incluyendo tamaño, carga superficial y eficiencia de carga del fármaco, mediante microscopía electrónica de transmisión, dispersión dinámica de la luz o HPLC. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de tumores porque las nanopartículas pueden entregar fármacos anticancerígenos poco solubles, lo que podría ser más efectivo que los tratamientos actuales. Aunque este método puede proporcionar información sobre el tratamiento del cáncer.

También puede utilizarse para estudiar otros sistemas, como el tráfico celular. Las nanopartículas pueden conjugarse con un ligando de direccionamiento y visualizarse in vivo o in vitro mediante el uso de un agente de imagen, demostrando así la técnica. Hoy estarán dos técnicos de nuestro laboratorio, Rohit Sukumar y Natalie Cummings, para comenzar la síntesis del copolímero PLGA PEG, disolviendo PLGA, carboxilato, en acetonitrilo a una concentración de cinco milimolar con agitación suave.

Luego, agregue suficiente NHS y EDC para obtener concentraciones de 25 milimolares, proporcionando un exceso estequiométrico de cinco veces en comparación con PLGA, y agite suavemente la solución durante aproximadamente una hora para permitir que el carboxilato de PLGA se convierta en PGA NHS. Después de una hora, precipite el producto de reacción de PGA NHS añadiendo la solución de lavado, metanol, en un volumen aproximadamente diez veces mayor, en exceso respecto a la solución; centrifugue la solución a 2000 × g para formar el pellet de P-L-G-A-N-H-S. Tras la centrifugación, deseche el sobrenadante para eliminar los rastros de EDC y NHS. Este procedimiento de lavado con metanol se repite al menos tres veces.

Una vez finalizado el lavado, seque el pellet de P-L-G-A-N-H-S bajo vacío durante 30 minutos para eliminar cualquier rastro de la solución de lavado. A continuación, vuelva a disolver el pellet de P-L-G-A-N-H-S en acetoni­trilo a la misma concentración que se utilizó inicialmente para disolver el PLGA.

Una vez disuelto, agregue PEG heterobifuncional a la solución de PLGA. Agregue una concentración de cinco milimolares.

Incube la solución de mezcla durante 24 horas con agitación constante después de 24 horas. Precipite el producto de reacción del copolímero en bloque PLGA PEG añadiendo metanol en exceso. Realice el lavado y el proceso de centrifugación tres veces adicionales para eliminar todo el PEG no reaccionado en exceso.

Como paso final en la síntesis, seque el copolímero en bloque PLGA PEG bajo vacío. La precipitación de nanopartículas comienza disolviendo el copolímero en bloque PLGA PEG y el fármaco que se encapsulará en el disolvente A-P-L-G-A. La elección del disolvente es crítica, ya que influye en las propiedades de la nanopartícula. Luego, añada la mezcla de polímero y fármaco gota a gota a tres o diez volúmenes de agua en agitación para obtener una concentración final de polímero de aproximadamente tres miligramos por mililitro. Gotas a gotas.

La adición de la solución orgánica a la fase acuosa es fundamental para formar nanopartículas del tamaño correcto. Continúe agitando durante dos horas bajo presión reducida para permitir que las nanopartículas se formen por autoensamblaje y eliminar los residuos del disolvente orgánico. Después de dos horas de agitación.

Concentre las nanopartículas mediante centrifugación a 2.700 × g durante 10 minutos utilizando un filtro Amon. Luego, lave las nanopartículas con PBS para eliminar cualquier fármaco no atrapado y proceda con la centrifugación. Finalmente, reconstituya las nanopartículas en PBS en este punto.

La caracterización biofísica básica, que incluye tamaño, carga superficial y eficiencia de carga del fármaco, puede realizarse para comprender mejor las propiedades de las nanopartículas. Las nanopartículas pueden almacenarse según lo descrito en el protocolo escrito; para caracterizarlas, se utilizó microscopía electrónica de transmisión para confirmar el tamaño, la distribución y la estructura de las nanopartículas de PLGA PEG. El tamaño de las partículas generalmente se encuentra en el rango de nanómetros.

Tamaños grandes de partículas con distribuciones de tamaño irregulares podrían indicar ya sea un error en la reacción de conjugación o que el método de nanoprecipitación necesita optimización. Aquí se muestra un estudio cinético de liberación de fármacos en el que se cuantificó la eficiencia de carga y la liberación de paclitaxel mediante HPLC estándar. Se dializaron cantidades fijas conocidas de las nanopartículas a intervalos de tiempo fijos.

Se recogió el contenido de la unidad de diálisis y se añadió un volumen igual de disolvente orgánico para disolver las nanopartículas. A continuación, se realizó HPLC en estas muestras. Para cuantificar el contenido de paclitaxel, una vez dominada, esta técnica de nanoprecipitación puede realizarse adecuadamente en tres horas.

Recuerde que al realizar esta técnica debe agregar siempre la fase orgánica lentamente a la fase acuosa para evitar la formación de partículas grandes tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores del cáncer en el campo de la nanomedicina exploraran el uso de fármacos poco solubles que antes se consideraban demasiado tóxicos en pacientes con cáncer tras este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como estudios de eficacia in vivo o estudios de imagen, para responder preguntas como si los fármacos poco solubles son efectivos cuando la toxicidad sistémica ya no es un problema, o si los ligandos de direccionamiento dirigen adecuadamente las nanopartículas hacia su destino.