Aislar las células que expresan LacZ de tejidos de ratón del oído interno mediante citometría de flujo

El objetivo general del siguiente experimento consiste en aislar células positivas para LAX Z del cóclea de ratón neonato mediante citometría de flujo. Esto se logra primero aislado un gran número de cócleas de ratón en un período de tiempo relativamente corto para mantener viables las células y disponer de un tejido inicial adecuado. Como segundo paso, las células positivas para LAX Z se disocian y luego se marcan para preparar el tejido para su clasificación.

Luego, las células se ordenan mediante citometría de flujo. Las poblaciones resultantes de LAX Z alta y baja lax pueden utilizarse entonces para experimentos adicionales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación auditiva, como cuáles son los perfiles genéticos o las poblaciones celulares específicas dentro del oído interno.

El procedimiento será demostrado por Taha Gen, un estudiante de medicina de nuestro laboratorio. Primero, llene platos de Petri de 35 milímetros con HBSS y colóquelos sobre un bloque de hielo. Luego, tras usar tijeras de iris para decapitar de 12 a 15 ratones postnatales, de cero a tres días de edad, con reportero axón dos laxy y tipo salvaje, ya eutanasiados.

Coloque las cabezas sobre una placa de Petri de 60 milímetros sobre un bloque de hielo. A continuación, utilice la pinza Dumont número cinco y tijeras de iris para extirpar la mandíbula y la lengua de las cabezas, y luego corte a través de la base del cráneo a la altura del paladar. Ahora retire la piel superpuesta del cráneo y seccione la base del cráneo insertando las tijeras en la parte inferior del foramen magno hasta el medio del paladar.

Realice otra incisión con las tijeras desde el borde cortado del paladar hasta la parte superior del cráneo en ambos lados. Tenga cuidado de no dañar la cápsula ótica. Luego, complete el aislamiento del hueso temporal realizando dos incisiones anguladas de 45 grados, que comienzan desde la parte superior del armazón y del foramen magno y se extienden hasta el corte coronal en el paladar duro.

Luego, coloque los huesos temporales aislados en las placas de Petri de 35 milímetros que contienen HBSS sobre el bloque de hielo y transfiera el bloque de hielo a una campana de disección estéril. A continuación, llene otra placa de Petri de 35 milímetros, esta vez con PBS, y colóquela sobre el bloque de hielo. Utilizando dos pinzas número 55.

Comience la microdisección retirando suavemente la corteza, el tronco encefálico y el cerebelo del hueso temporal que recubre la cápsula ótica. Luego, sin retirar la cápsula ótica, elimine partes de la cápsula coclear comenzando por la entrada del nervio vestibulococlear y continúe hacia el interior de la cápsula ótica. Tras exponer la base de la cóclea, extraiga suavemente el órgano de Corti y los tejidos circundantes.

Luego, comenzando desde la base, retire cualquier ganglio espiral y estría vascular residual y transfiera la cóclea a la placa de Petri llena de PBS. Pese 50 microlitros de PBS estéril en el centro de uno o dos pozos de una placa de cultivo de seis pozos sin recubrir. A continuación, transfiera no más de 20 axones, dos cócleas laxas, a cada gota de PBS.

A continuación, caliente previamente alícuotas de 50 microlitros de tripsina al 0,125% durante aproximadamente dos minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius. Luego, agregue la tripsina a la cóclea, teniendo cuidado de no agitar el recipiente.

Incube la cóclea a 37 grados Celsius durante ocho minutos. Detenga la digestión con tripsina añadiendo 50 microlitros de inhibidor de tripsina de soja a cada gota, y luego agregue 50 microlitros adicionales de medio completo después de ajustar una pipeta P-200 al volumen de 125 microlitros. Utilice una punta de pipeta romblada de 300 microlitros para agitar suavemente las células 80 veces, teniendo cuidado de no generar burbujas.

Luego, después de que cada gota haya sido triturada, agregue 200 microlitros adicionales de medio completo a cada una. Ahora pase las células a través de un filtro celular de 40 micrones hacia un nuevo pocillo dentro de la misma placa de seis pocillos y luego transfiera las células de cada pocillo a tubos cónicos individuales estándar.

A continuación, agregue 100 microlitros de células de tipo silvestre en cada uno de tres tubos, seguido de una dilución con 300 microlitros de medio completo solo para el CUG. Como control, diluya 10 microlitros de axón, dos células LAX Z, en 390 microlitros de medio completo. Transfiera las células axón dos LAX Z restantes a tubos de fax en 400 microlitros de OTs.

Luego de incubar los tubos en un incubador húmedo a 37 grados Celsius durante 10 minutos, añada 200 microlitros de CUG diluido a cada tubo de fax adecuado. A continuación, protegiendo todos los tubos de la luz, incube las células en un incubador húmedo a 37 grados Celsius durante 25 minutos. Para la tinción, mientras las células están incubando, coloque 10 mililitros de hepes recién preparado más FBS en un tubo de 15 mililitros y coloque el tubo en hielo.

Luego, agregue 1,8 mililitros de la solución fría de hielo a cada uno de los tubos fax bajo la campana estéril con las luces apagadas para minimizar la exposición a la luz. A continuación, centrifugue las células a 1200 RPM durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, retire el sobrenadante y re suspenda los pellets en 300 microlitros de medio completo.

Reúna todas las alícuotas para la muestra de clasificación y luego agregue yoduro de propidio a cada tubo adecuado hasta una concentración final de un microgramo por mililitro. Finalmente, después de cubrir las células nuevamente, colóquelas en hielo. Configure las compuertas de clasificación recolectando primero 1000 eventos de las células silvestres no teñidas para determinar la distribución celular en el gráfico de dispersión directa versus dispersión lateral.

Ajuste los parámetros de dispersión directa y lateral según sea necesario. Luego, realice la compensación con el tipo silvestre sin teñir, el tipo silvestre teñido con PI y el axón teñido con CUG. Dos células LAX Z.

Llene dos tubos de citómetro con 500 microlitros de medio completo. Luego inicie el análisis con las células de tipo silvestre teñidas con PI y la población de células teñidas con axón dos Lae CUG, utilizando la compuerta para excluir restos basándose en el gráfico de dispersión directa versus dispersión lateral. Excluya dobletes y agregados utilizando el gráfico de altura de dispersión directa versus área de dispersión directa.

Luego excluya las células muertas positivas para PI en función del gráfico de área de dispersión directa versus área de PE sci cinco. Para cada colocación de compuerta, configure un gráfico de área de dispersión directa versus área de azul cascada o azul Pacífico. Analice 10 000 eventos del tubo de muestra ordenado que contiene células teñidas con axón dos laxy PI y CUG utilizando todas las compuertas establecidas con las células de tipo silvestre mediante gráficos de las células de tipo silvestre.

Cree compuertas para las células con alta intensidad de azul de cascada que representen menos del 1 % del número total de eventos. Las compuertas de azul de cascada alto ahora deben contener aproximadamente del 15 al 20 % de las células en la muestra de Axon dos laxy. Utilizando estas células de Axon dos alto, y con el gráfico de análisis de células de Axon dos laxy, cree ahora una compuerta para las células con menor fluorescencia, del 15 al 20 %, empleando la estrategia de compuertas antes mencionada.

Ordene las células en los tubos de fács que contienen medio completo, manteniendo los tubos de recolección en una cámara enfriada a cuatro grados Celsius durante la ordenación. Registre el número de células contadas por el citómetro de flujo para cada población en estas dos figuras. Las áreas de dispersión lateral frente a las áreas de dispersión frontal del tipo silvestre disociado a la izquierda y del axón dos LA Z a la derecha.

Se muestran las células cocleares. Observe la selección de los grupos distintos de eventos de tamaño mucho mayor que los eventos más cercanos al eje Y, designados como la población negativa para restos celulares. Típicamente, se recupera de un 40 a 45 % de células libres de restos celulares tanto del oído interno de tipo salvaje como del oído interno axin dos LAX Z en estos dos paneles.

Se utiliza la altura del dispersión hacia adelante frente al área de dispersión hacia adelante para excluir dobletes de los restos previamente seleccionados. Se excluyen los eventos de la población negativa que se desvían de la naturaleza lineal esperada del gráfico. Esta preparación suele producir un 71,1 % de eventos dentro de la compuerta designada. Aquí.

El yoduro de propidio, detectado mediante el canal PE SCI de cinco canales, se utiliza para excluir las células muertas, como se observa en estos diagramas de dispersión. Aproximadamente el 95 % de las células ordenadas eran viables y no incorporaron PI en estos paneles. El canal azul Cascade se utilizó para detectar el sustrato fluorescente CUG, como se muestra en la figura de la derecha.

En promedio, las células positivas CUG superiores aproximadamente al 20 % son células lae altas que se correlacionan con unos 15 000 axones, dos células altas por cada 10 a 12 animales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y aislar células laxy altas mediante citometría de flujo a partir de tejidos del oído interno, tanto para experimentos de Turing celular como para experimentos como el perfilado genético.