RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans

El objetivo de este procedimiento es identificar reguladores posembriónicos de la expresión y localización de proteínas en C. elegans mediante una pantalla genómica basada en ARNi y proteínas marcadas con fluorescencia. Una vez construida la cepa adecuada para el cribado, se selecciona una biblioteca de ARNi. El primer paso del procedimiento consiste en empaquetar los clones de la biblioteca en bacterias.

Las bacterias se seleccionan, cultivan y se administran a nematodos de C. elegans en etapas determinadas. Después de permitir que los nematodos crezcan durante 72 horas, se observan alteraciones en el fenotipo de interés. Finalmente, los cambios en la expresión o en la localización subcelular de la proteína atacada se visualizan mediante microscopía de fluorescencia.

Este método puede identificar genes necesarios para la correcta localización subcelular de una proteína marcada con fluorescencia. Sin embargo, este protocolo puede modificarse para identificar genes que afecten otros fenotipos posembrionarios de interés. La ventaja principal de esta técnica frente a los protocolos publicados existentes es que hemos optimizado la consistencia y el nivel de la respuesta de ARNi en los animales mediante la inducción de la producción de ARN bicatenario en bacterias antes del siembra.

La persona que demostrará el procedimiento será Kathy Fuss, asociada de investigación de mi laboratorio. Dentro de los dos meses siguientes al inicio del experimento, prepare la biblioteca de clones; primero realice un aislamiento bacteriano a partir de clones seleccionados de la biblioteca de alimentación, así como de los controles positivo y negativo, en placas de LB con tetraciclina. Como control positivo, utilice un clon que contenga un gen que produzca un fenotipo pos-embrionario dependiente de la dosis, como BLE cuatro. Como control negativo, utilice un vector vacío o un clon que contenga un pseudogen predicho sin fenotipos observados.

Incube las placas durante la noche; para cada clon, inocule dos mililitros de medio LB que contenga 50 microgramos por mililitro de ácido carbónico con una colonia aislada de las placas de estría. Incube los cultivos durante la noche con agitación. A la mañana siguiente, las soluciones deben estar turbias; induzca la producción de ARN bicatenario añadiendo IPTG a los cultivos e incúbelos durante cuatro a cinco horas adicionales en las mismas condiciones.

Añadir IPTG asegura una inhibición inducida por ARNi más consistente y robusta del producto génico que depender únicamente del IPTG y del inductor de la placa NGM. Después de la incubación con IPTG, depositar 30 microlitros de cultivo de cada clon en cada pocillo de las placas NGM de ARNi preparadas de 24 pocillos. Un clon por pocillo. Cada placa debe tener dos pocillos destinados a los controles.

Marque cuidadosamente la ubicación de cada biblioteca. Clone en placas de 24 pocillos y coloque ahora las placas descubiertas en un flujo laminar estéril para que sequen durante aproximadamente 20 minutos. No permita que los bordes del agar se separen de la placa.

Una vez secos los nematodos en estadios definidos sobre las placas, se proporcionan instrucciones sobre la preparación de los nematodos. En la siguiente sección, comience con una población estadiada de nematodos en el primer estadio larval o L1. Comenzar con larvas L1 evita fenotipos letales embrionarios potenciales.

Tener una población de animales en etapas definidas para el cribado también aumenta la confianza en que cualquier variación observada se deba al ARNip y no simplemente a variaciones normales que ocurren en diferentes etapas. Sin embargo, si el ARNip provoca un retraso en el desarrollo, esto debe ser anotado por quien realiza el cribado. Población de etapas mixtas de la cepa utilizada en el cribado.

Solo los embriones protegidos por la cáscara sobrevivirán a esta etapa, estadiando los animales dentro de las 12 horas si se realiza a 20 grados Celsius o dentro de las 18 horas si se realiza a 16 grados Celsius el día en que se inoculan los cultivos bacterianos. Seleccione tres placas de 100 milímetros de animales de la cepa de tamizaje que estén sanos y contengan tanto larvas, adultos y embriones.

Lave todos los animales en medio M nueve estéril y transfiera el lavado a un tubo estéril de 15 mililitros con tapón de rosca. Si el lavado es mayor a 3,5 mililitros, centrifugue los animales y retire todo el líquido excepto 3,5 mililitros. Si es menor a 3,5 mililitros.

Aumente el volumen hasta 3,5 mililitros con agua o M nueve para liberar los embriones de los adultos en 1,5 mililitros de una mezcla de hidróxido de sodio y lejía por cada lavado. Deje que los animales se incuben durante no más de 10 minutos en esta solución. Después de iniciar un temporizador, vortex cada tubo durante 10 segundos y repita la vortexación cada dos minutos.

Después de cada vortexado, observe la solución bajo un microscopio estereoscópico en busca de cadáveres de animales. Dentro de los seis a ocho minutos, los adultos se fragmentarán y deberían liberarse los embriones. Retire los embriones de la solución de lejía centrifugándolos y eliminando la mayor cantidad posible del sobrenadante sin perturbar el precipitado.

Luego, resuspenda el precipitado en un volumen de 10 mililitros añadiendo M nueve estéril y agitando. Repita este proceso de lavado al menos una vez más hasta que el olor a lejía sea completamente indetectable. Para obtener un enquistamiento más estrechamente sincronizado, detenga a los animales en su estadio L uno haciendo eclosionar los embriones en medio M nueve sin alimento.

Esto se realiza transfiriendo los embriones en M nueve a un matraz erlenmeyer pequeño. Agite el matraz durante la noche a la temperatura adecuada para la cepa y el experimento. Durante este tiempo, los animales eclosionarán todos y se detendrán en la diapausa L uno al día siguiente.

Reanude el crecimiento de las larvas a partir de un punto temporal establecido transfiriéndolas a las bacterias preparadas que expresan ARN bicatenario. Este es el mismo día en que las placas de 24 pocillos han sido inoculadas con bacterias. Comience transfiriendo los animales L1 a un tubo de 15 mililitros y centrifugándolos. Luego concentre los animales en medio millilitro a un mililitro de medio M9 y coloque cinco microlitros de nematodos concentrados sobre una placa.

Cuente el número de animales en la placa y ajuste la solución concentrada de nematodos. Tres a 10 microlitros por cada 30 gusanos. Finalmente, coloque aproximadamente 30 µL de animales de una misma etapa sobre la bacteria en cada pocillo de la placa preparada.

Placa de 24 pocillos: más de 30 animales por pocillo puede provocar inanición. Después de que las gotas se sequen, lo cual tomará unos minutos, sujete la tapa con la banda de goma, incube los animales en posición invertida a la temperatura y duración requeridas, y luego analice los animales en la etapa deseada. Una vez que los nematodos estén listos para ser examinados, confirme que los controles positivo y negativo produzcan los fenotipos esperados. A continuación, observe los animales experimentales en busca de anomalías en el desarrollo.

A continuación, utilizando un microscopio estereoscópico, monte ocho a 12 animales de cada pocillo sobre portaobjetos de Agri PET al 4% con una gota de cinco microlitros de anestésico. Después de colocar el cubreobjetos adecuado, realice observaciones de al menos cinco animales utilizando microscopía compuesta. Mantenga una base de datos organizada del gen, el número de animales observados y los resultados fenotípicos.

Para cada experimento de ARNi, verifique cualquier fenotipo producido por el ARNi de R mediante otro fenotipo secundario, si es posible, y repitiendo el experimento; los experimentos repetidos pueden utilizar bacterias de la misma siembra. Las siembras más antiguas pueden dar lugar a un crecimiento deficiente en cultivos líquidos nocturnos y deben resiembrarse primero. Algunos cultivos bacterianos no crecerán bien debido al producto génico expresado en su plásmido.

En este caso, simplemente concentre las bacterias antes de sembrarlas. Para una criba en curso, es importante mantener siempre muchos embriones listos para su clasificación. La cepa utilizada en la criba siempre debe estar alimentada, no privada de alimento, y libre de contaminantes que puedan afectar el fenotipo de interés.

Establecimos un programa de mantenimiento para la alimentación de los animales. Los genes que afectan la localización de DBL uno se identificaron mediante ARNi utilizando una cepa diseñada para esta prueba. La expresión normal del marcador GFP en DBL uno incluye cuerpos celulares del cordón nervioso ventral y una fila de puntos en animales alimentados con AR antisentido dirigido contra DBL.

Un ARNm mostró una expresión severamente atenuada de DBL uno. Estos animales también eran pequeños, al igual que los animales que carecían de DBL L uno funcional. La pantalla de ARN I identificó con éxito muchos otros genes cuyos productos afectan la localización de DBL uno, ampliando así nuestra comprensión de cómo se transporta a nivel subcelular la TGF beta y proporcionando un punto de partida para muchas otras investigaciones.

Utilizando este método, una sola persona puede razonablemente preparar y observar de dos a cuatro series de experimentos cada semana. Por ejemplo, los animales preparados el lunes y el martes pueden observarse el jueves y el viernes respectivamente, y los animales pueden volver a prepararse el viernes y el sábado para el lunes y el martes. Observación mientras sigue este procedimiento durante todo su análisis.

Es importante mantener muchos embriones listos para la clasificación, por lo tanto conserve regularmente la cepa de cribado. Asimismo, es fundamental tomar notas detalladas de todas las observaciones.