Visualización de Ca Vascular ^{2 +} Señalización desencadenada por paracrina derivados ROS

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la señalización de calcio vascular desencadenada por especies reactivas de oxígeno derivadas de la pericrina o ERO. Esto se logra primero visualizando las ERO mediante colorantes sensibles a la oxidación en macrófagos activos. Las ERO también pueden visualizarse en células endoteliales utilizando sensores fluorescentes basados en plásmidos.

Luego, proceda a visualizar simultáneamente los macrófagos activados marcados con rastreador celular rojo y las células endoteliales marcadas con flu en un modelo de co-cultivo. Finalmente, mida la señalización de calcio en las células endoteliales desencadenada por las ERO derivadas de macrófagos mediante el uso de un sistema de imagen confocal.

Estos resultados pueden demostrar los niveles de ROS de forma independiente, así como evaluar simultáneamente la movilización intracelular de calcio desencadenada por el ROS derivado de Peregrine. Este método permite la evaluación simultánea de dos moléculas de señalización diferentes que provocan íntimamente una señalización vascular y un entorno patofisiológico simulado. Dos investigadores postdoctorales en mi laboratorio, Karthik y Raj, demostrarán el procedimiento sobre mediciones de ROS y calcio, y las interacciones entre macrófagos y células endoteliales.

Cultive macrófagos derivados de monocitos de ratón en placas de 35 milímetros con fondo de vidrio. Luego, estimule las células con agonistas del receptor tipo toll e incube durante seis horas a 37 grados Celsius. Para la visualización del citosol.

Añada el colorante sensible a la oxidación por ERO e incube las células durante 20 minutos. A continuación, visualice las células en una platina controlada en temperatura de un sistema de imágenes confocal. Alternativamente, para visualizar las ERO mitocondriales en células activadas por TLR, añada el indicador de superóxido mitocondrial e incube las células durante 30 minutos a 37 grados Celsius.

Como control negativo, trate las células con PBS o DMSO como control positivo. Trate las células con antimicina al dos milimolar. A continuación, proceda a visualizar todas las células en la platina controlada en temperatura de un sistema de imagen confocal.

Utilizando el software ImageJ, analice todos los datos de las imágenes. El sensor fluorescente detecta de forma hiperespecífica concentraciones submicromolares de peróxido y, en función del diseño del vector de expresión en mamíferos, puede dirigirse al citoplasma o a las mitocondrias. Mediante electroforesis, cree líneas estables de células endoteliales microvasculares pulmonares de ratón que porten el plásmido de expresión inadecuada de Hyper.

Para facilitar el crecimiento de colonias, siembre las células a baja densidad en TMEM completo e incube durante 48 horas; luego, reemplace el medio con medio de cultivo completo suplementado con un antibiótico de selección. Seleccione las colonias con el porcentaje más alto de células hiperpositivas y amplifique el cultivo para generar líneas estables hiperpositivas en experimentos individuales. Siembre las células sobre cubreobjetos recubiertos con gelatina al 0,2 % y cultive durante la noche hasta alcanzar una confluencia del 80 %.

Ahora active las células con ligandos de TLR e incube durante seis horas a 37 grados Celsius. Para la detección de ROS citoplasmático, monte las laminillas de células sobre una cámara de células adelo. Añada un mililitro de tampón salino equilibrado precalentado y coloque la cámara sobre una platina controlada en temperatura del sistema de imagen confocal.

Registre los cambios de fluorescencia en las células para la detección de ROS mitocondriales. Incluya un control positivo con dos micromoles de antimicina A. Luego prepare los cubreobjetos de las células tratadas para microscopía confocal. Realice el análisis de imágenes utilizando el software ImageJ.

Comience con células endoteliales cultivadas hasta un 80 % de confluencia sobre laminillas de vidrio recubiertas con gelatina para la visualización y medición de los cambios intracelulares de calcio. Incube las células con el colorante fluorescente fluo-4 AM a temperatura ambiente durante 30 minutos para minimizar la pérdida del colorante; lave las células con la solución de imagen experimental que contiene sulfinpirazona. A continuación, monte las laminillas en una cámara para células Adelo con 800 microlitros de solución de imagen experimental precalentada y coloque las células sobre la platina controlada en temperatura del sistema de imagen confocal en un tubo aparte.

Utilice 500 nanogramos por mililitro de rastreador celular rojo C-M-T-P-X durante 15 minutos para marcar la población de macrófagos bajo estudio, lave las células y resuspenda los pellet en 200 microlitros de solución de imagen experimental. A continuación, agregue los macrófagos marcados sobre las células endoteliales cargadas con fluoh 4:00 AM en el ensamblaje de la cámara para microscopía confocal y registre la fluorescencia verde y roja cada tres segundos durante 10 minutos.

En este experimento, las células J 7 74 0.1 fueron estimuladas con ligandos de TLR dos, tres y cuatro durante seis horas. Las imágenes confocales representativas muestran un aumento del ROS citosólico medido mediante DCF. Curiosamente, la fluorescencia roja de mitosox indica un aumento similar en el ROS mitocondrial.

Estos cambios de fluorescencia son cuantitativos. Por lo tanto, los resultados deben normalizarse y expresarse como cambio relativo por tratamiento; la señal de antimicina A valida un control positivo para la producción de ERO mitocondriales. Esta figura muestra imágenes de los niveles de peróxido endotelial, citosólico y mitocondrial en hiper citosol o hiper mito D estables.

MP ECS estimuladas con agonistas de TLR. La cuantificación del cambio de fluorescencia media demuestra un aumento de la fluorescencia hiper citosólica e hiper D mito tras seis horas de estimulación en un sistema de co-cultivo. Para evaluar la señalización de ROS de Peregrine, se aislaron macrófagos mirina frescos tanto de ratones de tipo salvaje como de ratones nulos GP 91 Fox, los cuales fueron activados con un microgramo por mililitro de LPS durante seis horas.

Los macrófagos fueron marcados en rojo con C-M-T-P-X y añadidos sobre flu verde cuatro. Cargado. MPM ecs. Curiosamente, los macrófagos activados con LPS aislados de ratones silvestres indujeron una movilización rápida y amplia de calcio en MPM ECS en comparación con los macrófagos de ratones GP 91 Fox nulos.

Aunque LI intente seguir este procedimiento, es importante recordar que tanto la descarga prolongada como la exposición al láser pueden provocar la autooxidación del DCF. Es fundamental evitar el blanqueo fotográfico de hyper cyto y hyper D mitral. Una vez dominada, la medición de RA en macrófagos, así como en células endoteliales, puede realizarse en siete horas si se lleva a cabo correctamente.