Aplicación de MassSQUIRM para mediciones cuantitativas de la actividad desmetilasa Lisina

El protocolo mass squirm tiene como objetivo cuantificar la actividad de lisina desmetilasa utilizando metilación isotópica y espectrometría de masas MALDI. Primero, realice reacciones de desmetilación catalizadas por enzimas sobre péptidos que contengan lisina metilada. Luego, methylate químicamente los productos peptídicos de la reacción desmetilasa con formaldehído deuterado para producir péptidos uniformemente metilados que ionizan de la misma manera mediante MALDI. A continuación, cuantifique cada especie peptídica mediante espectrometría de masas múltiple y tenga en cuenta la superposición isotópica. Con el fin de identificar las cantidades relativas de péptidos metilados no, mono, di y trimetilados, los resultados de mass squirm determinan las cantidades relativas de cada producto de la reacción desmetilasa basándose en los cambios de masa.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la espectrometría de masas rutinaria de moho es que la puntuación de masas tiene en cuenta las diferencias de ionización entre péptidos con distinta metilación. Tuvimos por primera vez la idea de este enfoque cuando desarrollamos un método para medir los niveles de acetilación de histonas utilizando anhídrido acético isotópicamente pesado. El desafío de esta técnica radica en la extracción de los datos del área de los picos, lo cual puede complicarse por la superposición de los envoltorios isotópicos de los péptidos.

Para la reacción de desmetilasa, combine 125 nanogramos de enzima recombinante desmetilasa específica de lisina uno con 0,25 microgramos de péptido de histona H3 dimetilado biotinilado en un volumen final de 20 microlitros de tampón desmetilasa. Preparar también una muestra control que contenga 0,25 microgramos de péptido sin la enzima LSD1. Incube las muestras de reacción y los tubos control durante dos horas a 37 grados Celsius. A continuación, para preparar R2, mezcle volúmenes iguales de perlas porosas de 20 micrones y metanol.

Luego, agregue 10 volúmenes de ácido trifluoroacético (TFA), añada ocho microlitros de perlas porosas a cada muestra y agite durante 15 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare dos puntas C18 tipo zip. Pipetee dos veces con 20 microlitros de TFA al 0,1 %, cuatro veces con acetonitrilo al 70 % en TFA al 0,1 % y otras cuatro veces con TFA al 0,1 %.

A continuación, cargue las dos muestras en las puntas zip previamente acondicionadas. Con una pipeta, pase el volumen a través de la resina C 18. Repita hasta que todo el volumen de ambas muestras haya pasado a través de las puntas zip.

Luego, lave las puntas tipo zip dos veces con 20 microlitros de TFA al 0,1 % y eluya las muestras en 40 microlitros de tampón ilusión. Proceda a secar completamente con un concentrador de vacío rápido. Primero, re suspenda la muestra en 100 microlitros de tampón fosfato 50 milimolar, pH 7,4. Luego, agregue ocho microlitros de dimetilamina y 16 microlitros de formaldehído desnaturalizado.

Incubar a cuatro grados Celsius durante dos horas. Repetir la metilación reductiva añadiendo dimetilamina borada y formaldehído deuterado e incubar durante dos horas. Por tercera vez, añadir dimetilamina borada e incubar a cuatro grados Celsius durante 15 horas.

Detenga la reacción con 12,5 microlitros de tris uno molar, pH 7,4, y proceda a secar completamente la muestra con un concentrador al vacío. En primer lugar, resuspenda las muestras de control y de reacción de desmetilasa en 100 microlitros de tampón fosfato 50 milimolar, pH 7,4.

Ahora agregue ocho microlitros de perlas porosas a las muestras de control y de reacción con desmetilasa y recójalas en puntas tipo zip como se mostró anteriormente. Eluya en volúmenes de dos microlitros sobre una placa de muestra para MALDI y deje secar a temperatura ambiente hasta la cristalización. Continúe con el análisis de las muestras mediante espectrometría de masas.

Abra los archivos espectro en el software de trabajo y exporte al software M sobre Z. Verifique además los productos de reacción mediante espectrometría de masas en tándem. Primero, determine la relación del área del pico de los isótopos de carbono 13 C dos y carbono 13 C cuatro respecto al pico mono-isotópico para la muestra control.

Utilice estas relaciones calculadas para cuantificar la cantidad relativa de péptido que existe en cada modificación. Estado de la muestra de reacción de desmetilasa. La enzima LSD1 puede utilizarse eficazmente en la cuantificación por espectrometría de masas de la desmetilación de lisina.

Dado que la reacción control no experimenta metilación reductiva, indica el envolvente isotópico típico para este péptido. Las áreas de los picos resultantes determinan las proporciones de fondo del péptido existente en carbono 13 C dos y carbono 13 C cuatro. Los estados isotópicos, así como las áreas de los picos del espectro de masas de la reacción control, permiten la cuantificación de la cantidad relativa de péptido existente en cada estado de modificación. En la reacción de desmetilasa, las áreas de los picos de estas reacciones control y desmetilasa determinan un 33,7 % de lisina dimetilada en el lisina 4, un 42,0 % de lisina monometilada en el lisina 4 y un 24 % de lisina no metilada en el lisina 4.

Este enfoque de squam en masa ofrece conocimientos clave en el campo de la epigenética de histonas, como la forma en que la desmetilación de residuos de lisina en histonas contribuye a diversas enfermedades. Aunque este ensayo de metilación se ha aplicado para estudiar desmetilasas, también puede utilizarse para investigar metiltransferasas.