Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados ​​celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons

El objetivo general del siguiente experimento consiste en medir en tiempo real las tasas de reparación del ADN y los extractos nucleares celulares mediante balizas moleculares que fluorescen una vez que se reparan. Las balizas moleculares para la reparación por escisión básica están compuestas por oligonucleótidos desoxi con una estructura de horquilla que contiene una lesión de base única, con seis grupos de oxifenilfluoresceína unidos a los extremos cinco primos y dil moti unido al extremo tres primos cuando están plegadas. El grupo fam se apaga de forma no fluorescente mediante dab sil a través de la transferencia de energía de resonancia de Förster.

Para evaluar la actividad de reparación del ADN, las balizas se incuban con extractos nucleares celulares, que contienen enzimas de reparación. La DNA glicosilasa reconoce y elimina la lesión en el ADN de la baliza. Los sitios ABA resultantes son sustratos para la AP endonucleasa uno o ape uno. Tras el reconocimiento, APE uno corta el esqueleto del ADN en el sitio ABA, permitiendo que el ADN que contiene el seis fam se disocie libremente del hairpin.

La separación del apagador resulta en un aumento de la fluorescencia que es proporcional al nivel de reparación del ADN y puede evaluarse en tiempo real utilizando una máquina de PCR cuantitativa en tiempo real. La capacidad de reparar el daño en el ADN es crucial para cada célula y cada organismo. Entre la multitud de vías celulares de reparación del ADN, la reparación por escisión de bases se dirige a bases dañadas que pueden resultar de agresiones oxidativas o químicas; elucidar el papel de elementos celulares individuales que podrían influir en la reparación por escisión de bases es uno de los principales objetivos en nuestros estudios de laboratorio.

Por tanto, medir con precisión y sensibilidad la actividad de reparación del ADN se ha convertido en un interés en nuestro laboratorio. Este ensayo puede proporcionar dichos datos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la marcación con 32P y el análisis mediante electroforesis en gel es que nuestra técnica no utiliza sustratos marcados radiactivamente, puede medir tasas de reparación directas en tiempo real y tiene un rango dinámico muy amplio.

Además, este enfoque puede utilizar varios fluoróforos diferentes y/o lesiones en la base para determinar la especificidad del sustrato. Hemos demostrado que este ensayo es altamente cuantitativo y muy sensible en diferentes condiciones. Este ensayo de baliza molecular de reparación por escisión de bases es adecuado para el análisis cinético.

La alta sensibilidad y especificidad del ensayo permite una cuantificación precisa de la reparación por escisión de bases, por lo que es útil para cribados de inhibidores de reparación o su validación. Además, es adaptable para medir la actividad de reparación en tejidos y lisados de células tumorales para mediciones funcionales de biomarcadores. Al diseñar balizas moleculares que se utilizarán en este ensayo, considere los siguientes oligonucleótidos de ADN de 43 bases de longitud, como se muestra aquí.

Trabajar bien. La secuencia de ADN no es única, pero debe permitir la formación de una estructura de horquilla. Cuando se pliega como se muestra aquí, la especificidad se logra mediante la inserción de lesiones de bases específicas, como uracilo o tetrahidrofuran.

En la posición X, seis bases desde el extremo cinco prime, el contenido de GC debe ser al menos del 32 % y no se debe colocar una base GB en el extremo cinco prime. Se debe conjugar seis carboxifluoresceína o seis FAM al extremo cinco prime y el extremo tres prime debe modificarse con DAB sil. Esto servirá como sustrato para las proteínas de reparación del ADN, asegurando la unión y la actividad de las glicosilasas.

La posición de la lesión se ha elegido para proporcionar suficiente espacio desde la estructura del asa en horquilla y el extremo del ADN. La longitud del tallo o del dúplex en horquilla debe ser de un mínimo de 15 pares de bases. Se recomienda una longitud del bucle de 13 bases.

La baliza molecular de control debe ser idéntica a la baliza molecular experimental, excepto en que no contiene una lesión en el ADN. Por lo tanto, no debería ser reconocida por las enzimas de reparación del ADN. Una vez que se tengan las balizas moleculares, se debe realizar una evaluación de calidad para asegurar que las balizas no fluoreszcan hasta que se calienten.

Y para determinar la temperatura óptima de fusión, todos los pasos durante el procedimiento de extracción deben realizarse sobre hielo o a cuatro grados Celsius. Para garantizar la estabilidad de las proteínas, prepare el experimento enfriando previamente. Dos vasos de precipitados de un litro por muestra, tampón de diálisis, cámaras de diálisis, microcentrífuga, tubos, jeringas y agujas.

Etiquete tubos cónicos de 15 mililitros y colóquelos en hielo. Aspire el medio de crecimiento de las células y luego lávelas dos veces con 7,5 mililitros de PBS frío tras el segundo lavado. Añada cinco mililitros de PBS frío a cada placa y utilice un lifter celular para desprender las células de la placa.

Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros enfriado y luego centrifugue a 500 veces G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Después de la centrifugación, elimine el sobrenadante y estime el volumen celular empaquetado comparándolo con volúmenes conocidos de líquido en tubos similares. Centrifugue los tubos durante un minuto más y luego retire el PBS restante con una pipeta.

Suspenda el sedimento celular en 150 microlitros del reactivo de extracción nuke buster uno por cada 50 microlitros de volumen celular empaquetado. Luego, transfiera las células resuspendidas a un tubo de 1,5 mililitros previamente enfriado e incube en vórtex durante 15 segundos a alta velocidad. Tras la agitación, incube el tubo en hielo durante cinco minutos, luego agite nuevamente en vórtex durante otros 15 segundos y centrifugue a 13.000 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Tras la centrifugación, retire y deseche el sobrenadante, que contiene la fracción citoplasmática. Resuspenda el precipitado en una mezcla de un microlitro de inhibidor de proteasas 100x, un microlitro de DTT 100 milimolar y 75 microlitros de reactivo de extracción nuke buster por cada 50 microlitros de volumen celular empaquetado.

Vortexe las células durante 15 segundos a alta velocidad. Incube en hielo durante cinco minutos y vortexe nuevamente durante 15 segundos a alta velocidad. Centrifugue a 13.000 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, use una jeringa para transferir el sobrenadante, que contiene las proteínas nucleares, a una cinta de diálisis deslizable con un límite de peso molecular de 7.000.

A continuación, añada 500 microlitros de DTT un molar a 500 mililitros de tampón de diálisis previamente enfriado y someta el lisado a diálisis durante 90 minutos a cuatro grados Celsius con agitación suave. Tras 90 minutos, transfiera el cassette de diálisis a un segundo vaso que contenga 0,5 litros de tampón de diálisis previamente enfriado con DTT y realice una nueva diálisis del lisado durante 90 minutos a cuatro grados Celsius con agitación suave. Tras la diálisis, el extracto podría haber cristalizado debido a las altas concentraciones de proteína.

A continuación, inserte una nueva jeringa en un puerto diferente al que se utilizó para inyectar el casete y recoja la solución de proteína nuclear dializada del casete de diálisis. Trate de incluir los cristales de aspecto turbio al retirar la solución de proteína nuclear dializada. Aliquote la muestra en tubos microcentrífugos de 20 microlitros cada uno, congélelos rápidamente en hielo seco y luego almacénelos a menos 80 grados Celsius hasta su uso.

Determine la concentración de proteína y realice el control de calidad según se describe en el documento adjunto. Para realizar el ensayo con balizas moleculares, descongele y diluya los lisados celulares hasta dos microgramos por microlitro de proteína con tampón de reacción de reparación por escisión básica que contenga un milimolar de DTT; diluya las balizas moleculares hasta 200 micromolares con el tampón de reacción de reparación por escisión básica. Dado que el equipo de PCR cuantitativa en tiempo real normalmente no se utiliza como fluorímetro, cambie el método de corrida en el equipo de PCR cuantitativa en tiempo real para que recoja datos cada 20 segundos a 37 grados Celsius durante al menos 180 ciclos.

Luego, cada 20 segundos durante 15 ciclos en la fluorescencia máxima de la baliza molecular para obtener datos para la normalización. Ajuste el volumen de reacción a 25 microlitros. A continuación, configure el diseño de la placa en el instrumento utilizando el software de Applied Biosystems con la curva estándar seleccionada como tipo de experimento y complete la distribución de la placa.

Se muestra un ejemplo en esta tabla, que también puede encontrarse en el documento adjunto. No agregue nada al pocillo seleccionado como curva patrón. Coloque el tampón de reacción de reparación por escisión básica, DTT y el lisado celular a una concentración de dos microgramos por microlitro, así como todas las balizas moleculares que se utilicen en el experimento, sobre hielo.

Luego, agregue el DTT al tampón de reacción de reparación por escisión básica hasta alcanzar una concentración final de un milimolar. Pipete 15 microlitros del tampón de reacción de reparación por escisión básica con DTT en cada pocillo de una placa óptica de Q-R-T-P-C-R compatible sobre hielo. A continuación, siguiendo el diseño de la placa, pipetee las balizas en los pocillos correspondientes.

Cada combinación de lisado y baliza molecular o control debe ensayarse por triplicado. Por último, pipetee cinco microlitros por pozo del lisado nuclear diluido en los pozos correspondientes. Es importante recordar mantener todos los reactivos de la baliza molecular fríos y pipetear los lisados en la placa como último paso.

Recuerde que los lisados contienen proteínas activas y comenzarán a reparar las sondas moleculares tan pronto como se pipeteen en la mezcla de reacción. Por lo tanto, es muy importante mantener todos los reactivos fríos para minimizar la cantidad de reparación de sondas que ocurre antes de comenzar a tomar mediciones. Una vez que se haya agregado todo, selle la placa con una película adhesiva óptica y mezcle golpeando suavemente la placa.

Luego, realice una centrifugación rápida de diez segundos para reunir las soluciones en el fondo de los tubos o de la placa tras la centrifugación; inserte la placa en el equipo de PCR cuantitativa en tiempo real e inicie el ensayo. Tras su finalización, exporte los datos brutos preferiblemente en formato Excel y siga las instrucciones del documento adjunto para analizar los datos una vez realizados los cálculos necesarios. Represente gráficamente los datos de fluorescencia normalizados como porcentaje de FAM libre frente al tiempo en segundos en un diagrama de dispersión con los errores correspondientes para evaluar la actividad de reparación del ADN y la calidad de los extractos nucleares de las células LN 4 28 y de una línea celular con sobreexpresión de MPG denominada LN 4 28 MPG. El ensayo descrito en este video se realizó utilizando una baliza molecular que contiene el sustrato APE uno tetra furina como control positivo.

Como se muestra en esta figura, ambas líneas celulares presentan una actividad robusta de APE1, indicada por la pendiente pronunciada, y actividad de ADN glicosilasa específica para la eliminación del sustrato MPG. Se midió la hipoxantina (indicada como HX) en lisados nucleares de ambas líneas celulares. Cada lisado se analizó utilizando una baliza molecular de control de reparación por escisión de bases o una baliza molecular de reparación por escisión de bases para HX; para la baliza de control se muestra LN 4 28 en verde y LN 4 28 MPG en púrpura para la baliza de hipoxantina.

LN 4 28 se muestra en azul y LN 4 28 MPG se muestra en naranja. Los resultados se informan como A unidades medias de fluorescencia y B, fluorescencia normalizada. En cada célula se produjo un aumento dependiente del tiempo en la fluorescencia, indicativo de la reparación de HX.

Lisado incubado con la baliza molecular HX como se esperaba. La línea celular LN 4 28 MPG indicada por el trazo naranja mostró una tasa de reparación mucho mayor, como lo indica la acumulación más rápida de fluorescencia, en comparación con la línea celular parental LN 4 28, que tiene una cantidad mínima de proteína MPG. Por lo tanto, la tasa de reparación de lesiones específicas del ADN por proteínas de reparación específicas puede medirse en extractos celulares en tiempo real con niveles mínimos de fondo de escisión no específica del ADN.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar sus balizas moleculares y medir tasas de reparación del ADN en tiempo real utilizando proteínas purificadas o lisados celulares. En cuanto al análisis, es esencial evaluar el rango dinámico y los valores de fondo; para ello, incluya reacciones de control, como las que contienen balizas de control positivo y negativo o no las contienen. Debido a la variabilidad entre pocillos, es útil normalizar los datos de los pocillos individuales respecto a los valores iniciales.

Estos están determinados por el paso más fino en la temperatura de fusión. Esto, junto con la inclusión de otros colorantes como un colorante rock, explicará la variabilidad inherente a los errores de pipeteo o a las diferencias en los detectores. Esta técnica nos permitió elucidar la influencia de los componentes individuales de la reparación por escisión en la actividad y capacidad general de reparación.

Es lo suficientemente sensible como para revelar pequeños cambios que no habrían sido detectables con métodos convencionales.