Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad
25 de febrero de 2012
Tandem purificación de afinidad es un enfoque sólido para la identificación de socios de la unión a proteínas. Como prueba de concepto, esta metodología se aplicó a la traducción factor eIF4E bien caracterizado iniciación a co-precipitado los factores implicados en la célula huésped iniciación de la traducción. Este método se adapta fácilmente a cualquier proteína celular o viral.
El objetivo general de este procedimiento es utilizar un método conocido como purificación por afinidad en tándem para aislar los factores de unión de proteínas. Hola, soy dLAN Bailey de la sección de Virología del Imperial College London. En nuestro laboratorio, trabajamos en las interacciones entre virus y huésped para diferentes miembros de la familia de virus.
La identificación de proteínas que interactúan con otras proteínas celulares o virales es un excelente punto de partida para investigar la interacción entre el virus y su huésped durante la infección. En este video, explicaré un enfoque que utilizamos en nuestro laboratorio: la purificación por afinidad en tándem, o marcaje TAP. La etiqueta TAP utilizada en este estudio es una etiqueta en el extremo N-terminal que consta de dos unidades de proteína G y un péptido de unión a estreptavidina.
Estos están separados por una secuencia de escisión de la proteasa TEV que permite la elución específica de la proteína cebo. En este ejemplo, EIF cuatro E de ratón se encuentra en el extremo C de este constructo de fusión. El protocolo de etiquetado TAP es un procedimiento de seis pasos.
Después de la transfección y la generación de líneas celulares, las células se inducen para expresar la proteína de interés con marca antes de ser lisadas en un tampón de lisis suave. Se utilizan dos pasos de purificación por afinidad y dos soluciones específicas para purificar la proteína de interés y cualquier posible socio de interacción, con el fin de generar líneas celulares. Las células HEC 293 deben transfectarse con el vector de expresión P met cuatro que codifica.
Las células con la proteína cebo marcada con la etiqueta tap se seleccionan entonces con cien microgramos por mililitro de higromicina B. Dado que el plásmido se mantiene de forma episomal, no es necesario aislar clones específicos. Diez frascos de células confluentes se inducen mediante tratamiento con 10 micromolares de cloruro de cadmio durante 16 horas antes de rasparlas y transferirlas al medio. Las células en suspensión se transfieren entonces a tubos de 15 M y se pelan mediante centrifugación.
Estas células se lavan luego tres veces con PBS frío con hielo antes de ser finalmente centrifugadas. En el paso dos, la lisis celular, las células se rompen en cinco mililitros de tampón de lisis frío mediante pipeteo repetido y luego se dejan en hielo durante cinco minutos. Para garantizar una lisis eficiente, las células se pasan a través de una aguja roma de calibre estrecho y se someten a ciclos de congelación y descongelación.
El estado resultante se distribuye en tubos de 1,5 mL y las células y restos celulares se eliminan mediante centrifugación. Cabe señalar que el tamaño del sedimento se reduce notablemente tras este paso de centrifugación. Los sobrenadantes del lisado se combinan entonces en un tubo cónico de 15 mL y se pasan a través de un filtro de 0,45 micrómetros para eliminar cualquier resto adicional.
Se deben tomar alícuotas de 50 microlitros de este lisado para su posterior análisis. Esta muestra se denomina muestra uno. Paso tres, unión a Aeros de IgG de conejo.
En esta etapa del protocolo, las etiquetas de proteína G se inmunoprecipitan mediante anticuerpos de conejo IgG aros. Para distribuir las perlas aros, retire el extremo de la punta de ape. Esto ayuda a evitar dañar las perlas.
Reuspenda suavemente la solución de aros de IgG de conejo mediante agitación giratoria del frasco antes de retirar los aros a un tubo de 15 ml. Lave los aros tres veces con tampón de lisis frío utilizando centrifugación de baja velocidad para clarificar las perlas en cada paso. Las perlas de IgG de conejo sedimentadas deben ser visibles tras la centrifugación.
Después de cada paso, retire cuidadosamente el tampón sin perturbar las perlas. Una vez completado el último lavado, agregue el lisado filtrado y clarificado a las perlas empaquetadas e incube durante tres horas o durante la noche. Se prefiere hacerlo a cuatro grados C utilizando un mezclador rotatorio.
Después de la inmunoprecipitación, centrifugar los microgránulos de agarosa y eliminar el sobrenadante para su posterior análisis. Si es necesario, se puede utilizar una punta fina para eliminar cualquier líquido residual de este tubo. Este sobrenadante es la muestra dos paso cuatro de la escisión con la proteasa TEV.
En este paso, el cebo se escinde de las etiquetas de proteína G. Este paso permite la escisión específica de la proteína de captura, funcionando efectivamente como un paso de elución a partir de la inmunoprecipitación con IgG de conejo en perlas aros. Prepare la mezcla de escisión por TEV y añádala a las perlas aros utilizando una punta ape con su extremo recortado, transfiera esta mezcla a un tubo microcentrífugo silanizado e inviértalo para suspender las perlas aros antes de la incubación nocturna a cuatro grados C. Retire una alícuota de esta reacción de escisión por TEV para su análisis.
Esta es la muestra tres. La incubación nocturna en el mezclador rotatorio debe permitir que la reacción de TEV avance casi hasta su finalización. Paso cinco, unión para inmovilizar las perlas de estreptadina.
En este paso, el cebo Cleve y cualquier posible pareja de unión se purifican por afinidad a partir de la solución. En primer lugar, centrifugue la reacción de escisión TEV que contiene las perlas de IgG de conejo aros. Para obtener el sedimento de aros, retire un OTT del sobrenadante clarificado para su análisis.
Esta es la muestra cuatro. Retire cuidadosamente todo el sobrenadante restante, que contiene su proteína de atracción, hacia un tubo nuevo. Nuevamente, utilice finamente.
Forme un pico con las puntas para eliminar todo el sobrenadante posible. Retenga las perlas de IgG de conejo aros para el análisis posterior. Esta es la muestra cinco.
Para evitar dañar las perlas de strep adin, retire el extremo de una punta de pipeta tipo pet. Resuspenda suavemente las perlas y retire un alícuota a un tubo silanizado. Lave las perlas que contienen strep adin con tampón S, clarificando mediante centrifugación a baja velocidad.
Después de cada lavado. Después de cada lavado, retire cuidadosamente el tampón. Las perlas Strept adin son muy pequeñas y pueden desplazarse fácilmente incluso al usar punta fina.
Construya consejos para mascotas. Después de que las perlas de estreptavidina hayan sido lavadas, agregue el sobrenadante de la reacción de escisión por TEV a estas perlas e incube la reacción durante tres horas o durante la noche a cuatro grados C, utilizando un mezclador rotatorio.
Después de la incubación, centrifugue para separar las perlas de estreptavidina y elimine el sobrenadante. Esta es la muestra seis. Vale la pena destacarlo.
La proteína Beit ahora está asociada con las perlas restantes en el tubo. Lave las perlas de estreptavidina que contienen su proteína cebo con tampón de lisis. Para eliminar cualquier proteína contaminante adicional, retire la solución de lavado restante de las perlas y déjelas sobre hielo.
Paso seis, elución con biotina. En este paso, se añade biotina a las perlas de estreptavidina. La interacción entre la biotina y las perlas de estreptavidina desplaza el cebo, que vuelve a la solución.
Añada la solución de biotina directamente a las perlas e invierta para mezclar. Incube la reacción a cuatro grados C durante tres horas o durante la noche utilizando un mezclador rotatorio. Centrifugue la mezcla de biotina y aerosol y recopile cuidadosamente la mezcla en un tubo nuevo. Esta es su EIT final, denominada muestra siete.
Las perlas de estreptavidina restantes son la muestra ocho. Debido a su baja concentración de proteína, este eluato final debe concentrarse antes del análisis. Esto se logra utilizando columnas centrífugas con corte de peso molecular bajo, reduciendo el volumen mediante centrifugación y monitoreando regularmente el proceso.
Esta muestra concentrada puede dividirse y analizarse en geles SDS-PAGE mediante tinción con Coomassie y plata. Si las muestras deben analizarse mediante espectrometría de masas, recomendamos utilizar geles comerciales precolados. Posteriormente, se pueden extraer las bandas individuales y las proteínas identificadas mediante espectrometría de masas.
En este caso, el cebo era murino, EIF para la proteína E. La ventaja del sistema tap es que tiene la capacidad de expresar su proteína de interés en una línea celular particular, y dependiendo de la línea celular en la que esté interesado, también le brinda la posibilidad de expresar la proteína a niveles relativamente bajos. Usted decide y todas las modificaciones postraduccionales y la localización se conservan, por lo que a menudo puede purificar el complejo nativo.
Resumen
La purificación por afinidad en tándem es una técnica potente para identificar socios de unión de proteínas. Este método se aplicó al factor de iniciación de la traducción eIF4E para co-precipitar factores de la célula huésped implicados en la iniciación de la traducción.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Virología
- Estudios de interacción de proteínas
- Biología celular
Antecedentes
- La purificación por afinidad en tándem (TAP) es un método utilizado para aislar complejos proteicos.
- La etiqueta TAP consiste en la proteína G y un péptido de unión a estreptavidina.
- Esta técnica permite la elución específica de las proteínas señuelo.
- Comprender las interacciones proteicas es fundamental para estudiar la dinámica virus-huésped.
Objetivo del estudio
- Aislar e identificar proteínas que interactúan con el factor de iniciación de la traducción eIF4E.
- Investigar la interacción entre proteínas virales y del hospedador durante la infección.
- Demostrar la adaptabilidad del método TAP para diversas proteínas.
Métodos Utilizados
- Transfección de células HEC 293 con un vector de expresión marcado con TAP.
- Lisis celular y purificación utilizando perlas de IgG de conejo y estreptavidina.
- Escisión con proteasa TEV para la elución específica de las proteínas señuelo.
- Múltiples pasos de lavado y centrifugación para garantizar la pureza de las muestras.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de eIF4E y sus proteínas asociadas.
- Demuestra la eficiencia del método TAP en la identificación de complejos proteicos.
- Identificación de posibles factores del huésped implicados en la iniciación de la traducción.
- Validación de la adaptabilidad del método para otras proteínas.
Conclusiones
- La purificación por afinidad en tándem es un enfoque eficaz para estudiar interacciones proteicas.
- El método puede aplicarse a diversas proteínas celulares y virales.
- Comprender estas interacciones proporciona información sobre la patogénesis viral.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación de interacciones proteína-proteína es un paso fundamental en la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en los programas de descubrimiento biofarmacéutico. La purificación por afinidad en tándem (TAP) permite el aislamiento de complejos proteicos nativos en condiciones cercanas a las fisiológicas, lo que respalda una interacción confiable con la diana y la asignación de rutas metabólicas. Este enfoque reduce los falsos positivos en las fases iniciales de cribado y mejora la confianza predictiva en las campañas de identificación de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de socios de unión directos e indirectos de proteínas cebo como eIF4E.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de objetivos mediante la identificación de miembros conocidos del complejo, tales como eIF4G, 4EBP-1, eIF4A y la proteína de unión a poli-A.
- Valor predictivo: Mejora la selección de carteras al distinguir interactores específicos del fondo utilizando controles con etiqueta TAP sola.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para procesos posteriores mediante la captura de complejos endógenos con modificaciones postraduccionales preservadas.
- Valor operativo: Permite la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante pasos definidos de elución (proteasa TEV y biotina) y protocolos de lavado rigurosos.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma en diferentes líneas celulares mediante la expresión de plásmidos episomales, evitando la generación de líneas clonales.
Investigación Translacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Mantiene la relevancia de la enfermedad al estudiar la eIF4E en la iniciación de la traducción dependiente del capuchón, una vía alterada en el cáncer y en la infección viral.
- Alineación Preclínica: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la reducción mecanicista del riesgo mediante la identificación de interactores secundarios que aportan contexto a la vía.
- Avance Ajustado al Riesgo: Informa las decisiones de continuar o no continuar al aclarar el mecanismo del blanco y la integridad del complejo antes de la optimización del fármaco líder.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
TAP se integra en el continuo de descubrimiento que va desde los ensayos de interacción con el blanco hasta la validación preclínica, particularmente para blancos en los que la integridad del complejo nativo es fundamental para su función.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante el aislamiento de complejos asociados a eIF4E bajo expresión inducible.
- Tamizaje: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante resultados cuantitativos a través de bandas identificables por espectrometría de masas tras separación por SDS-PAGE.
- Análisis: Permite el análisis comparativo entre condiciones mediante pasos específicos de elución que reducen la unión no específica.
- Investigación Traducional: Se relaciona con la alineación de biomarcadores al identificar factores de iniciación de la traducción relevantes para la señalización oncogénica.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable para múltiples proteínas cebo debido al diseño modular de la etiqueta TAP y al sistema de expresión episomal.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos, reducción de ambigüedad mecanicista y preservación de complejos nativos.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad entre líneas celulares y proteínas cebo.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases tardías mediante la caracterización temprana de complejos.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en datos validados del interactoma.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en clonación molecular, transfección transitoria y técnicas de purificación por afinidad.
- Depende del acceso a infraestructura de centrifugación, mezcladores rotatorios, inhibidores de proteasas y espectrometría de masas.
- Necesita una estandarización entre equipos en el diseño de etiquetas, protocolos de inducción y rigurosidad de lavados.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes proteínas cebo, niveles de expresión y localización subcelular.
- Incluye limitaciones prácticas, como la posible interferencia de la etiqueta y la necesidad de optimizar el momento de inducción y las condiciones de lisis.
