Identificación y caracterización de la glicosilación de proteínas específicas de uso de endo-y exoglicosidasas
26 de diciembre de 2011
Usando glicosidasas específicas para eliminar los azúcares de las glicoproteínas seguido de SDS-PAGE es un método útil para detectar las modificaciones de glicanos de las muestras de proteínas y es una buena opción para los estudios de glicobiología inicial. Siguientes cambios deglicosilación pueden ser detectados como cambios en la movilidad en gel o por tinción con glicano reactivos sensibles.
El objetivo general del siguiente experimento es ilustrar el uso de glicosidasa para la desglicosilación enzimática y el análisis de la glicosilación N y O enlazada en una glicoproteína modelo. Esto se logra tratando una glicoproteína con PGA's F o con la mezcla de desglicosilación de proteínas. Además, la mezcla de desglicosilación de proteínas se complementó con una mezcla de exoglicosidas adicionales, que en ocasiones ayudan a eliminar azúcares que de otro modo serían resistentes.
Ilustramos este método utilizando un modelo de glicoproteína, la gonadotropina coriónica humana recombinante beta o HCG beta, seguido de SDS-PAGE, tinción con azul de Kumasi y un método de tinción específico para azúcares. Se utiliza Pro Q Emerald 300 para analizar la glicosilación D. Se obtienen resultados de la muestra de HCG beta, que muestran que la HCG beta está heterogéneamente glicosilada y contiene múltiples glicoformas, basado en las diferencias en la migración proteica con y sin tratamiento glicosilado y en la señal disminuida en la tinción con ProQ a medida que los glicanos se eliminan sucesivamente.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el análisis por espectrometría de masas, es que es sencilla, utiliza equipos de laboratorio comunes y es adecuada para el biólogo novel en glicobiología. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la glicobiología, como por ejemplo si mi proteína está glicosilada. Para comenzar la desglicosilación enzimática, descongele los tampones suministrados en el kit de desglicosilación de proteínas.
Mezcle los tubos completamente y manténgalos a temperatura ambiente. Coloque los viales que contienen la enzima en hielo, disuelva el contenido del vial de beta HCG en 600 microlitros de agua destilada y manténgalos en hielo. Después de preparar un mililitro de tampón 1X G7 diluyendo el stock 10X en agua destilada, use 25 microlitros para diluir 0,5 microlitros de PGA's f.
Prepare la mezcla de exoglicósidos combinando dos microlitros de cada uno de los cuatro exoglicósidos. A continuación, agregue HCG beta y tampón desnaturalizante 10 x para glicoproteínas a siete tubos PCR numerados según se indica en el protocolo escrito, tape los tubos y mezcle suavemente. Desnaturalice las proteínas en el termociclador incubando durante 10 minutos a 94 grados Celsius, seguido de una permanencia a cuatro grados Celsius. Después de retirar los tubos del termociclador, centrifugue para eliminar cualquier condensación visible. A cada tubo de reacción, agregue los reactivos restantes según lo indicado en el protocolo escrito. Cierre los tubos PCR utilizando nuevas tapas.
Luego, mezcle los tubos golpeando suavemente cuatro veces tras centrifugar los contenidos, coloque los tubos en el termociclador e incube a 37 grados Celsius durante cuatro horas. A continuación, enfríe las muestras a cuatro grados Celsius. Para preparar la electroforesis SDS-PAGE, prepare un tampón de carga SDS reductor al 3 x fresco.
Con DTT, agregue 12,5 microlitros del tampón de carga SDS reductor al 3x preparado a cada muestra, cierre los tubos con nuevas tapas y golpee suavemente los tubos para mezclar. Incube los tubos en un termociclador a 94 grados Celsius durante cinco minutos, luego enfríe a cuatro grados Celsius. Tras la incubación, cargue 30 microlitros de cada muestra y 10 microlitros del marcador de proteínas en un gel de tri-glicina del 10 al 20 %. Guarde el resto de cada muestra.
Electroforesis en gel a 130 voltios hasta que el frente de D esté cerca de la parte inferior del gel. Cuando finalice la electroforesis, retire el gel del molde y colóquelo en una caja de plástico pequeña con suficiente tinción azul de kumasi para cubrir el gel. Incube el gel durante una hora con agitación suave después de teñirlo.
Lave tres veces durante 30 minutos. En 50 mililitros de solución de retención, registre las imágenes utilizando un transiluminador de luz blanca o un escáner. Alternativamente, el gel puede secarse entre hojas de celofán.
En un marco, corra el resto de cada muestra y un marcador de proteínas en un gel de Tri-glicina del 10 al 20 % mientras el gel está en marcha. Disuelva el reactivo ProQ Emerald en DMF y prepare las soluciones stock de fijación, lavado y oxidación para la tinción siguiendo el manual del producto proporcionado con el kit. Cuando la electroforesis esté completa, retire el gel del molde y colóquelo en una caja de plástico.
Fije el gel añadiendo 100 mililitros de la solución fijadora preparada. Deje el gel durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave al día siguiente. Lave el gel con 100 mililitros de la solución de lavado preparada durante 10 a 20 minutos a temperatura ambiente con agitación suave, repitiendo el lavado una segunda vez con solución de lavado fresca.
A continuación, oxide los carbohidratos incubando el gel con agitación suave durante 30 minutos en 25 mililitros de la solución oxidante preparada, siga la incubación con dos lavados adicionales mientras el gel se está lavando. Prepare la tinción fresca con ProQ Emerald 300 añadiendo 500 microlitros de la solución del reactivo ProQ Emerald 300 a 25 mililitros del tampón de tinción proporcionado en el kit. Tiña el gel incubándolo en la tinción preparada en condiciones oscuras con agitación suave durante 90 a 120 minutos posteriores a la tinción del gel.
Repita los dos pasos de lavado según se describió anteriormente. Luego registre las imágenes con un transiluminador UV a 300 nanómetros. Como paso final, compare las imágenes del gel teñido con kumasi con las del gel teñido con ProQ Emerald.
Los cambios en la migración de proteínas tras la desglicosilación enzimática pueden observarse al comparar la muestra control con el tratamiento F de PGA. Para eliminar los glicanos N y mediante el tratamiento con la mezcla de desglicosilación para eliminar los glicanos N y O, no se observa una reducción adicional en el tamaño tras la digestión con glicosidasa adicional. Además de un cambio en la masa, las bandas se vuelven más nítidas a medida que se eliminan los glicanos.
Una banda que se desplaza por debajo del marcador de 17 kilodalton probablemente representa el polipéptido beta de HCG completamente desglicosilado. Las calles cinco a siete muestran las bandas correspondientes a la forma glicosilada. Otras bandas podrían derivarse de una desglicosilación incompleta o de múltiples proteínas no identificadas presentes en la muestra del beta de HCG.
El reactivo verde esmeralda oxida y tiñe todos los glicanos presentes en una molécula proteica. Por lo tanto, la intensidad de la señal disminuye a medida que la beta HCG se desglicosila enzimáticamente. La señal residual en los carriles tres y cuatro indica la presencia de motivos de glicanos resistentes a las enzimas utilizadas.
Se utiliza el glucósido adicional en la banda cuatro. Elimine algunos residuos de azúcar adicionales. La migración de la proteína es la misma, pero se puede observar una ligera reducción en la intensidad de la tinción.
Las moieties de azúcares resistentes no estaban presentes en todas las especies proteicas. Algunas bandas no fueron detectadas por Emerald Green, lo que indica que fueron extensamente desglicosiladas. Datos adicionales respaldan la conclusión de que la beta HCG está heterogéneamente glicosilada. La banda inferior en la calle dos es tenue en la imagen de Emerald Green.
Aunque la banda superior en la segunda pista es brillante, lo que indica que aún están presentes muchos grupos GLYCAN, estos datos respaldan la conclusión de que la hCG beta recombinante expresada en células de ratón contiene múltiples formas glicósidas debido a la heterogeneidad inherente de la glicosilación. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la espectrometría de masas, para responder preguntas adicionales, tales como: ¿cuál es la tasa de ocupación? ¿Cuál es el grado de glicosilación, o cuál es la estructura fina de los glicanos?
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la glicosilación para la desglicosilación enzimática y el análisis de glicanos unidos a NNO en glicoproteínas. La elección del método de detección puede ser difícil porque las tinciones proteicas son útiles solo si la desglicosilación provoca un cambio significativo en la masa molecular de otras proteínas.
Hemos observado migraciones anormales tras la desglicosilación y hemos encontrado que cualquier cambio en la migración es evidencia de que la proteína ha sido desglicosilada.
Descripción general
Este estudio demuestra el uso de glicosidasas para la desglicosilación enzimática de glicoproteínas, centrándose en la gonadotropina coriónica humana recombinante beta (HCG beta). El método permite el análisis de la glicosilación N- y O-vinculada mediante SDS-PAGE y técnicas específicas de tinción.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Glicobiología
- Análisis de proteínas
- bioquímica
Antecedentes
- La glicosilación es una modificación postraduccional crítica que afecta la función de las proteínas.
- Las técnicas de deglicosilación son esenciales para estudiar las modificaciones por glicanos.
- La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS es un método común para analizar la movilidad de las proteínas.
- Métodos específicos de tinción pueden resaltar la presencia de glicanos.
Objetivo del estudio
- Ilustrar el proceso enzimático de desglicosilación utilizando glicosidasas.
- Analizar las modificaciones de los glicanos en una glicoproteína modelo.
- Proporcionar un método sencillo para investigadores novatos en glicobiología.
Métodos Utilizados
- Tratamiento enzimático de la beta HCG con glicosidasas específicas.
- Electroforesis SDS-PAGE para la separación de proteínas según peso molecular.
- Tinción con azul de Kumasi para la visualización general de proteínas.
- Tinción con ProQ Emerald 300 para la detección específica de glicanos.
Resultados principales
- La beta-HCG exhibió patrones heterogéneos de glicosilación.
- Se observaron cambios en la migración de las proteínas tras la desglicosilación.
- La intensidad de la señal disminuyó con la eliminación de los glicanos.
- La comparación de geles teñidos reveló diferencias en la presencia de glicanos.
Conclusiones
- El método es eficaz para analizar modificaciones de glicanos en proteínas.
- Proporciona una alternativa sencilla frente a técnicas más complejas como la espectrometría de masas.
- Los resultados pueden ayudar a responder preguntas fundamentales en glicobiología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La desglicosilación enzimática mediante el uso de glucosidasas proporciona un método rápido y accesible para evaluar la heterogeneidad de las glicoproteínas, lo que apoya la validación temprana de objetivos al aclarar el estado de las modificaciones postraduccionales. Este enfoque permite a los equipos de I+D de biofármacos evaluar los efectos mediados por glicanos sobre la estabilidad, el tráfico y la función proteica sin necesidad de instrumentación especializada. El método contribuye a la reducción de riesgos mecanicistas en los flujos de trabajo de descubrimiento al relacionar los patrones de glicanos con resultados funcionales en sistemas relevantes para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la heterogeneidad de la glicosilación para evaluar su impacto en la función proteica y la interacción con el blanco.
- Valor operativo: Utiliza equipos y reactivos de laboratorio estándar, lo que permite la criba rápida de variantes de glicoproteínas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera formas proteicas con glicanos truncados para su uso en ensayos estandarizados que requieren glicoproteínas definidas.
- Valor operativo: Produce preparaciones proteicas consistentes y reproducibles, adecuadas para formatos de cribado de alto rendimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya el análisis de isoformas de glicoproteínas relevantes para enfermedades mediante la resolución de microheterogeneidad mediada por glicanos.
- Valor operativo: Facilita la comparación de lotes de glicoproteínas recombinantes para garantizar la consistencia en estudios preclínicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se enmarca en el continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores, donde la caracterización de glicoproteínas aporta información sobre las relaciones estructura-función y las evaluaciones de desarrollabilidad.
- Biología del Descubrimiento: Esclarece el papel de los glicanos N- y O-enlazados en el plegamiento proteico, la estabilidad y la actividad celular.
- Detección: Permite la preparación de controles desglicosilados para ensayos de unión o enzimáticos dependientes de glicanos.
- Análisis: Proporciona lecturas cualitativas y semicuantitativas mediante desplazamientos en geles e intensidad de tinción específica para glicanos.
- Investigación Traducional: Ayuda a alinear los perfiles de glicoproteínas recombinantes con las isoformas nativas observadas en muestras clínicas.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad escalable y modular aplicable a múltiples objetivos de glicoproteínas en un portafolio.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al aislar las contribuciones de los glicanos al comportamiento de las proteínas.
- Valor operativo: Requiere únicamente incubadoras estándar, centrífugas y sistemas de electroforesis en gel.
- Valor estratégico: Informa decisiones de avance o interrupción al revelar riesgos relacionados con los glicanos en la capacidad de producción y la farmacocinética.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos de glicoproteínas según la trazabilidad de la glicosilación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de glicoproteínas y en la optimización de reacciones enzimáticas.
- Depende del acceso a enzimas glicosidasas específicas (por ejemplo, PNGase F, O-Glicosidasa, mezclas de exoglicosidasas).
- Necesita la estandarización de los protocolos de desnaturalización, incubación y tinción entre diferentes equipos.
- Puede requerirse adaptación para estructuras de glicanos no estándar o sistemas de expresión de glicoproteínas atípicos.
- Se limita al análisis cualitativo o semicuantitativo; se necesitan métodos complementarios (por ejemplo, espectrometría de masas) para la secuenciación detallada de glicanos.
