Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

El objetivo general de este procedimiento es aislar complejos de ribosomas unidos a cadenas nacientes, o RNCs, asociados al SEC TED 70 s, producidos durante la traducción en un sistema libre de células in vitro. Esto se logra primero introduciendo una secuencia de retención SEC M de 17 aminoácidos de longitud en el extremo C-terminal del gen de interés y clonándolo aguas abajo del promotor transcripcional T siete. A continuación, el ARNm se transcribe mediante una reacción de transcripción in vitro y luego se purifica.

Luego, el ARNm purificado se traduce en un sistema de extracto de E. coli S30 con aminoácidos radiactivos para marcar la proteína sintetizada o la cadena polipeptídica en crecimiento. Finalmente, los complejos de cadenas en crecimiento unidos a los segundos ribosomas Mr.Ed se aíslan mediante centrifugación en gradiente de sacarosa y fraccionamiento. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran que las cadenas en crecimiento están establemente unidas al ribosoma 70S mediante análisis por electroforesis en gel de los polipéptidos marcados aislados de las fracciones del gradiente.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el uso de ARNm que carece de codón de terminación, es que garantiza con alta eficiencia la unión de la cadena polipeptídica naciente al ribosoma 70 S durante la traducción y el paso subsiguiente de centrifugación. Además, en contraste con la tecnología de no-stop codón, este método puede utilizarse con eficiencia casi igual tanto en sistemas in vitro como in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del plegamiento proteico traduccional, como la formación de diversos intermediarios de plegamiento traduccional en las primeras etapas de la traducción, y además contribuir al análisis de su estructura mediante métodos estructurales directos o indirectos.

Enfoques de sondeo y determinación Esta técnica puede ayudarnos a descifrar la vía del plegamiento proteico en el ribosoma. En este protocolo, hemos descrito el aislamiento de cadenas nacientes de cristalina bina gamma B unidas a ribosomas 70 s de longitud completa. Sin embargo, esta técnica puede utilizarse para el aislamiento de diversas enfermedades de prácticamente cualquier proteína de interés.

Esta estrategia también puede adoptarse para aislar cadenas polipeptídicas natin truncadas del derm Es. Generalmente, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades durante el paso de centrifugación en gradiente de sacarosa. Sin embargo, para quienes tienen experiencia, esto no debería ser un problema. Decidimos utilizar una segunda secuencia de detención para aislar los polipéptidos nacientes de cristalina gamma B unidos al ribosoma 70S tras intentos iniciales menos exitosos que implicaban el uso de ARNm sin codón de paro.

La técnica posterior no pudo garantizar la estabilidad de los RNC durante los pasos subsiguientes de centrifugación con la misma eficiencia que la técnica que implica el uso de la secuencia de arresto SECM. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos que involucran la preparación del gradiente y la separación de los RNC pueden ser difíciles de aprender y requieren un determinado nivel de experiencia para asegurar resultados reproducibles. La demostración del procedimiento la realizará un estudiante de posgrado de mi laboratorio para llevar a cabo la transcripción y traducción in vitro. Comience con un gen de interés clonado en cualquier plásmido basado en T siete y/o SP seis para generar complejos ribosoma-cadena naciente o RNC.

Extienda el extremo C del polipéptido diana añadiendo la secuencia inductora de arresto de M para asegurar que el fragmento del polipéptido saldrá al exterior del túnel ribosómico. Añada un enlazador flexible rico en glicina y serina entre la proteína y la secuencia de arresto SEC M para preparar la transcripción in vitro; utilice una enzima de restricción que corte aguas abajo del marco de lectura abierto para linealizar el ADN molde y realice una electroforesis en gel AROS para verificar la digestión completa de la muestra. Tras verificar la concentración óptima de ADN, utilice un kit de transcripción de alto rendimiento según las instrucciones del fabricante para sintetizar el ARN mensajero.

Utilice la precipitación con cloruro de litio para purificar el ARNm. Luego, analice una muestra en un gel de acrilamida o aros para verificar su pureza. Para la traducción in vitro.

Utilizando un sistema de e coli en agua libre de nucleasas, agregue una mezcla de aminoácidos de un milimolar, menos metionina, 10 unidades de inhibidor de ribonucleasa, 20 microcurios de 35 s metionina, 20 microlitros de mezcla de reacción, 24 microlitros de tampón de reconstitución y 24 microlitros de lisado de e coli. Precaliente la reacción incubándola a 30 grados Celsius durante cinco minutos. Luego, agregue uno a dos microgramos de ARNm e incube durante 10 a 15 minutos adicionales a 30 grados Celsius.

Detenga la reacción colocándola en hielo para aislar complejos de cadena en crecimiento unidos al ribosoma 70 s o ncs. Coloque la reacción de traducción encima de 4,5 mililitros de un gradiente de sacarosa del 5 al 30 % en 20 milimolar de HEPES, hidróxido de potasio pH 7,5, 15 milimolar de magnesio, 100 milimolar de acetato de potasio y 1 milimolar de DTT. Centrifugue a 41 000 RPM durante dos horas a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, fraccione el gradiente de sacarosa utilizando un sistema programable de gradientes de densidad y un detector de absorbancia ajustado a 254 nanómetros.

Recolecte las fracciones que contienen ribosomas 70 s para su análisis posterior y determinar si la proteína extendida SEC M permanece unida al ribosoma 70 s. Precipite la proteína en cada fracción del gradiente añadiendo ácido tricloroacético. Incube las muestras durante la noche a cuatro grados Celsius; al día siguiente, centrifugue las muestras a 14.000 veces G durante 15 minutos para formar el pellet proteico, y lave los pellets en una proporción de cuatro partes de acetona por una parte de tris milimolar, HCl pH 7,6.

Seque las pastillas al aire, luego resuspenda en tampón de carga para electroforesis SDS-PAGE. Separe las muestras mediante electroforesis SDS-PAGE en gel de tris-tricína, a continuación fije y seque los geles y expóngalos a autorradiografía e imagen de fosfo como se muestra aquí. Tras la traducción in vitro, los ribosomas 70 S se aislaron mediante centrifugación en gradiente de sacarosa y fraccionamiento para asegurar que la proteína cristalina gamma B permanezca establemente unida al ribosoma.

Las fracciones que contenían partículas de 70 s fueron agrupadas, se intercambió el tampón mediante desalinización y se sometieron a una ronda adicional de centrifugación en gradiente de sacarosa. Los resultados aquí presentados sugieren que SEC M puede inducir eficientemente la parada traduccional de los RNCs de gamma B cristalina. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un día laborable, con la excepción del análisis mediante electroforesis en gel de la cadena naciente, que normalmente incluye un paso de precipitación con ácido tricloroacético que requiere incubación nocturna.

Si bien se intenta este procedimiento, es obviamente crítico evitar la contaminación por ARN en cualquier paso. La contaminación por ARN puede afectar la eficiencia traduccional del extracto y provocar la liberación del polipéptido naciente del ribosoma 70S. Tras seguir este procedimiento, se pueden obtener NAST y polipéptidos de longitud predeterminada unidos de forma estable al ribosoma 70S, dependiendo del objetivo final.

Estos complejos pueden utilizarse para diversos fines, como la determinación de la conformación de cadenas nacientes unidas al ribosoma mediante enfoques directos e indirectos, como RMN o FRET, o para probar la unión de factores y ligandos tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural y el plegamiento de proteínas exploraran la conformación de proteínas completas unidas al ribosoma, así como los intermediarios del plegamiento co-translationales. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo preparar y aislar polipéptidos nacientes unidos de forma estable al ribosoma 70S, los cuales pueden utilizarse posteriormente para responder diversas preguntas en el campo del plegamiento proteico traduccional.

No olvide que trabajar con isótopos radiactivos y aminoácidos marcados, como, por ejemplo, metionina A 35, requiere precauciones especiales y siempre debe tenerse en cuenta al realizar este procedimiento.