Un ensayo de cribado para la identificación de moduladores fluorescente de canales GIRK
24 de abril de 2012
Un tiempo real procedimiento de detección para identificar los medicamentos que interactúan con la proteína G-gated K hacia el interior del rectificador + (GIRK) canales se describe. El ensayo utiliza la membrana potencial sensibles tintes fluorescentes para medir la actividad GIRK canal. Esta técnica es adaptable para su uso en un número de líneas celulares.
El objetivo general de este procedimiento es identificar nuevos fármacos que modularán los canales grk. Esto se logra primero sembrando las células A TT 20 en la placa de 96 pocillos. El segundo paso consiste en diluir los compuestos de prueba utilizando el sistema automático de manipulación de placas líquidas Verset.
A continuación, los compuestos de prueba diluidos se aplican a las células utilizando el verset. El paso final consiste en insertar la placa de 96 pocillos en el lector de placas fluorescente Synergy Two e inyectar las soluciones de control y de somatostatina en los pocillos. En última instancia, el lector de placas fluorescente se utiliza para identificar los compuestos que alteran la señal fluorescente inducida por la somatostatina y, por lo tanto, modulan los canales Grk.
La ventaja de este procedimiento frente a métodos existentes como el registro mediante parche, es que se puede tamizar rápidamente un gran número de compuestos para determinar si modulan los canales Gerk. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento del dolor, porque se pueden identificar compuestos que activen el canal Gerk, lo cual conduce a la inhibición de la transmisión nociceptiva FI. Demostrando el procedimiento para el recubrimiento. Las placas de 96 pocillos y el sembrado de las células es realizado por Maribel Vasquez.
Un estudiante en mi laboratorio comience este procedimiento cultivando las células pituitarias A TT 20 en DMEM suplementado con 10% de suero de caballo a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida con 5%CO2. Mantenga el cultivo subcultivando las células cada cinco a siete días utilizando un procedimiento de estandarización. A continuación, recubra los pozos del negro transparente.
Placa de 96 pocillos inferior con 50 microlitros de poli-L-lisina. Deje que los pocillos sequen durante 30 minutos en el incubador. Luego, elimine el exceso de poli-L-lisina y siembre las células en la placa de 96 pocillos que contiene 200 microlitros de medio, a una densidad de 30.000 células por pocillo.
Después, almacene las células en el incubador durante tres o cuatro días. Utilice un sistema de aspiración para aspirar lentamente el medio de cultivo de la monocapa celular, luego lave las células con 200 microlitros de solución tampón normal. Posteriormente, agregue 200 microlitros de solución tampón que contenga el colorante sensible al potencial de membrana a cada una.
Incube bien las células durante 40 minutos a 37 grados Celsius. Después de 40 minutos, retire las células A TT 20 del incubador y déjelas regresar a la temperatura ambiente; aspire el tampón viejo. Luego, agregue una solución de tampón fresca que contenga el MPD a las células.
A continuación, utilice el sistema de manipulación de líquidos para aplicar diversas concentraciones de los compuestos de prueba y soluciones de control a las células. Incube las células durante cinco minutos en la placa de 96 pocillos con los compuestos de prueba antes de realizar las mediciones fluorescentes. En este procedimiento, coloque la placa de 96 pocillos en un lector de placas fluorescente Biotech Synergy Two.
Obtenga la señal de fondo fluorescente a una longitud de onda de exudación de 520 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 560 nanómetros. Posteriormente, aplique los ligandos GPCR o la solución control a los pocillos para activar los canales GIR mediante el sistema inyector Synergy dos. Luego, recolecte los puntos de datos a intervalos de diez segundos durante un período de muestreo de 302 segundos.
En las longitudes de onda de excitación y emisión. Calcule el factor Z para determinar la confiabilidad del ensayo. Factores Z en el rango de 0,5 a 1,0 indican que la calidad del ensayo es excelente.
Las placas con factores Z inferiores a 0,5 se excluyen. A partir del análisis, los compuestos que modulan la señal fluorescente se vuelven a probar en presencia de cloruro de bario dos milimolar o terapina Q 500 nanomolar para confirmar la especificidad del canal de potasio rectificador entrante. Aquí se muestra una señal fluorescente representativa HLB 0 2 1 1 15 2 medida a lo largo del tiempo en células A TT 20 tras la adición de somatostatina o solución control. La razón de la intensidad fluorescente en el eje Y se calculó dividiendo la señal en presencia de somatostatina o de la solución control entre la señal basal medida antes de la adición de somatostatina o solución control.
Se muestra aquí el tratamiento de las células A TT 20 con 500 nanomolares. La terapina Q inhibe la disminución mediada por somatostatina en la señal fluorescente al unirse a dos y bloquear los canales G. Y se muestra aquí el tratamiento de las células A TT 20 con propafenona 20 micromolar, que también inhibe la disminución mediada por somatostatina en la señal fluorescente. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas si se lleva a cabo correctamente.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar fármacos que modulan los canales grk utilizando un lector de placas fluorescente.
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Descripción general
Este artículo describe un procedimiento de cribado en tiempo real para identificar fármacos que interactúan con los canales de potasio rectificadores hacia adentro regulados por proteínas G (GIRK). El ensayo utiliza colorantes fluorescentes sensibles al potencial de membrana para medir la actividad de los canales GIRK, lo que lo hace adaptable a diversas líneas celulares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Farmacología
- Neurociencia
- Electrofisiología
Antecedentes
- Los canales GIRK desempeñan un papel crucial en la señalización neuronal.
- La identificación de moduladores de los canales GIRK puede conducir a nuevas estrategias terapéuticas.
- Los ensayos en tiempo real mejoran la eficiencia del cribado de fármacos.
- Los colorantes fluorescentes proporcionan una medida sensible de la actividad del canal.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un procedimiento para la selección de fármacos que modulen los canales GIRK.
- Utilizar un formato de alto rendimiento para probar múltiples compuestos.
- Mejorar la comprensión de la farmacología de los canales GIRK.
Métodos Utilizados
- Placa de células A TT 20 en una placa de 96 pocillos.
- Uso del sistema de manipulación de líquidos Verset para diluir los compuestos de prueba.
- Aplicación de los compuestos diluidos a las células con el Verset.
- Uso de un lector de placas fluorescente Synergy dos para medir las respuestas.
Resultados principales
- Identificación de compuestos que alteran las señales inducidas por somatostatina.
- Demuestra la adaptabilidad del ensayo a diversas líneas celulares.
- Modulación exitosa de la actividad de los canales GIRK por los compuestos evaluados.
- Validación de la eficacia del lector de placas fluorescente en cribados.
Conclusiones
- El ensayo desarrollado es una herramienta valiosa para el descubrimiento de fármacos dirigidos a los canales GIRK.
- El cribado en tiempo real puede acelerar la identificación de terapéuticas potenciales.
- Se necesitan estudios adicionales para explorar las implicaciones clínicas de los compuestos identificados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este ensayo permite la identificación de alto rendimiento de moduladores del canal GIRK, apoyando la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos en neurociencia y cardiología. Al proporcionar lecturas cuantitativas de fluorescencia en tiempo real, reduce la dependencia de la electrofisiología de bajo rendimiento y acelera el progreso de hits a líderes. El método mejora la confianza predictiva en las primeras etapas del descubrimiento al vincular los efectos de los compuestos con la actividad funcional del canal en un contexto celular fisiológicamente relevante.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la medición de la modulación funcional de los canales GIRK en respuesta a ligandos del receptor acoplado a proteína G (GPCR).
- Valor operativo: Permite la criba rápida de bibliotecas de compuestos para identificar activadores o inhibidores con especificidad mecanicista.
- Valor predictivo: Apoya la reducción del riesgo del blanco al confirmar la actividad sobre el blanco mediante cambios en la señal de fluorescencia correlacionados con la salida de iones K⁺.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Utiliza colorantes sensibles al potencial de membrana (DiBAC4(3) o HLB 021-152) para generar señales cuantificables en tiempo real tras la activación de GIRK.
- Reproducibilidad: El cálculo del factor Z (rango excelente: 0.5–1.0) asegura la robustez del ensayo para la selección de compuestos activos y la reproducibilidad de las campañas.
- Escalabilidad: Compatible con formato de 96 pocillos y sistemas de manipulación de líquidos (por ejemplo, Verset) para dispensación automatizada de compuestos y cribado.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Los moduladores identificados podrían orientar estrategias terapéuticas para el dolor neuropático, la adicción y las arritmias cardíacas mediante la inhibición neuronal mediada por GIRK.
- Continuidad traslacional: Las lecturas fluorescentes proporcionan un puente entre la interacción con el blanco y la respuesta funcional, facilitando la vinculación del fenotipo en etapas preclínicas.
- Reducción del riesgo mecanicista: La especificidad se confirma mediante inhibidores como el cloruro de bario o la Terapina Q, para distinguir los efectos mediados por GIRK de la actividad fuera del blanco.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en la continuación del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, permitiendo la selección funcional de moduladores de GIRK antes de la optimización posterior.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la vinculación de la activación de los RCPG con cambios en la fluorescencia dependientes de GIRK, aclarando la modulación de la vía.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante la carga estandarizada de colorantes, la aplicación de compuestos y la medición cinética de la fluorescencia durante 300 segundos.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes (relaciones de intensidad de fluorescencia) que permiten comparar la potencia y eficacia de los compuestos.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos al identificar compuestos que alteran la excitabilidad neuronal mediante GIRK, lo cual es relevante para modelos de dolor y adicción.
- Reutilización Empresarial: Plataforma adaptable a diferentes líneas celulares y ligandos de RCPG, que promueve su reutilización en múltiples campañas de validación de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la modulación del blanco al reducir la ambigüedad mecanicista en la selección de fármacos para canales iónicos.
- Valor operativo: Ofrece estandarización, reproducibilidad y datos cinéticos en tiempo real inalcanzables con ensayos de punto final.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir una validación funcional temprana, reduciendo el riesgo de fracaso en fases avanzadas debido a la falta de interacción con el blanco.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de compuestos con actividad GIRK confirmada para su avance hacia la optimización del fármaco líder.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular (células AT T20), manipulación de colorantes fluorescentes y operación de lectoras de placas cinéticas.
- Depende de una lectora de placas de fluorescencia con capacidad de inyección (por ejemplo, Synergy 2) y ajustes de excitación/emisión compatibles (520 nm/560 nm).
- Necesita la estandarización de la carga del colorante, tiempos de incubación y condiciones del tampón entre pocillos y placas.
- La adaptación a otras líneas celulares requiere la validación de la expresión de GIRK y la eficiencia de carga del colorante.
- Limitación práctica: debe confirmarse la especificidad del ensayo mediante inhibidores ortogonales (por ejemplo, Ba2+, Terapin Q) para excluir cambios de fluorescencia no mediados por GIRK.
