La conversión de un ELISA de captura para un ensayo de Luminex xMAP utilizando un anticuerpo Multiplex Método de detección

El objetivo general del siguiente experimento consiste en convertir un ensayo Eliza previamente optimizado para la citocina TNF alfa a la plataforma Xap, al mismo tiempo que se evalúan pares alternativos de anticuerpos. Esto se logra acoplando el anticuerpo de captura del kit ELIZA, junto con otros tres anticuerpos de captura candidatos, a cuatro conjuntos diferentes de microesferas o partículas, que se mezclan entre sí. Estos cuatro conjuntos permiten probar simultáneamente los cuatro candidatos con cuatro anticuerpos de detección distintos, con el fin de determinar el mejor par de anticuerpos.

A continuación, se construyen dos ensayos Xap con los dos pares de anticuerpos más óptimos. Luego, se compara el rendimiento de los ensayos con el del ensayo EISA original en cuanto a intensidad de señal, rango dinámico y sensibilidad. Los resultados muestran que anticuerpos similares pueden tener un comportamiento muy diferente bajo las mismas condiciones y que varios anticuerpos pueden cribarse simultáneamente utilizando el ensayo Xap de Luminex, lo que revela que este ensayo presenta una sensibilidad y un rango dinámico aumentados en comparación con el EISA.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el EIS A es que los inmunoensayos basados en xap permiten al investigador probar múltiples dianas, o como en este caso, probar múltiples anticuerpos simultáneamente. Para identificar el mejor anticuerpo demostrado. El procedimiento lo realizará Erica Lopez, científica asociada en Luminex Corporation.

Comience este protocolo con la selección y preparación de cuatro anticuerpos de captura y cuatro anticuerpos de detección específicos para el TNF alfa humano, tal como se describe en el protocolo escrito. Además, prepare un anticuerpo de confirmación específico para la especie huésped de los anticuerpos de captura. Lleve los reactivos del kit de acoplamiento de anticuerpos a temperatura ambiente.

Etiquete cuatro tubos de reacción con los números de región de las perlas seleccionados para la reacción de acoplamiento. Transfiera el contenido de los cuatro viales de microesferas mag plex a los cuatro tubos de reacción etiquetados. Lave cada conjunto de perlas dos veces con 500 microlitros de tampón de activación y active cada conjunto de perlas con las soluciones de sulf ONHS y EDC según se describe en el kit de acoplamiento de anticuerpos.

Manual del usuario: tras una incubación de 20 minutos en un rotador, repita el paso anterior de lavado con las perlas ahora activadas un total de tres veces con 500 microlitros de tampón de activación. Para cada lavado, prepare cuatro soluciones separadas de 500 microlitros, cada una conteniendo 7,5 microgramos de anticuerpo de captura en tampón de inactivación.

Agregue estas cuatro soluciones de anticuerpos de captura a sus respectivos tubos de reacción. Vortexee inmediatamente cada tubo e incube durante dos horas en un rotador. Repita el paso de lavado con las perlas ya acopladas un total de tres veces con 500 microlitros del tampón de lavado incluido en el kit de acoplamiento de anticuerpos.

Después del último paso de lavado, añada 500 microlitros de tampón de lavado a cada tubo de reacción para obtener una concentración final de stock de 5 millones de microesferas acopladas a anticuerpos por mililitro, vortexee y luego someta los tubos de reacción a sonicación para dispersar las microesferas. Cuente el número de microesferas recuperadas tras la reacción de acoplamiento utilizando un contador de células o un hemocitómetro. La recuperación tras la reacción de acoplamiento suele ser superior al 90 %. Confirme que la reacción de acoplamiento fue exitosa preparando soluciones de prueba de los stocks de microesferas acopladas para cada conjunto, con una concentración final de 100 microesferas por microlitro en tampón de ensayo, y prepare una dilución de la especie antis marcada con eritrina FICO.

Anticuerpo de confirmación de IgG a cuatro microgramos por mililitro en tampón de ensayo. Aliquotar 50 microlitros de cada solución de prueba en cuatro pozos de una placa de 96 pozos con fondo redondo, para un total de 16 pozos. Luego, añadir 50 microlitros de tampón de ensayo en ocho de los pozos para medir el fondo, y 50 microlitros del anticuerpo de confirmación diluido en los ocho pozos restantes. Mezclar suavemente las reacciones pipeteando arriba y abajo varias veces con un pipetador multicanal.

Cubra la placa e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador para placas. Coloque la placa sobre un separador magnético durante uno o dos minutos para atraer las perlas fuera de la solución. Luego, elimine el líquido invirtiendo con fuerza la placa mientras está sobre el separador, por encima de un recipiente de desecho.

Lave cada pocillo dos veces añadiendo 100 microlitros de tampón de ensayo y eliminando el SANE de la placa de manera similar. Utilizando el separador magnético de placas, re suspenda las perlas en 100 microlitros de tampón de ensayo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo cinco veces con un pipetizador multicanal. Analice en un instrumento Luminex xap, como el instrumento magix.

La intensidad de la señal fluorescente de esta reacción es directamente proporcional a la cantidad de proteína en la superficie de las perlas, lo que proporciona una evaluación rápida de la cantidad relativa de proteína acoplada a las perlas. Para determinar el par de anticuerpos más eficaz en el ensayo xap, prepare una mezcla inicial de los cuatro conjuntos de perlas añadiendo 10 microlitros de cada uno a 0,96 mililitros de tampón de ensayo. Prepare las soluciones de anticuerpo de detección diluyendo cada anticuerpo a un microgramo por mililitro en tampón de ensayo.

También un tampón de ensayo. Prepare el estándar de proteína TNF alfa a 2000 picogramos por mililitro y diluya la estreptavidina R FICO erina a ocho microgramos por mililitro. Añada 50 microlitros de la mezcla de anticuerpos acoplados a perlas a cada uno de los 16 pozos de una placa de 96 pozos con fondo redondo CoStar para el ensayo de cribado.

Luego, agregue 50 microlitros de tampón de ensayo a ocho de los 16 pocillos para medir el fondo. A continuación, pipetee 50 microlitros del estándar de TNF alfa en los otros ocho pocillos para medir la respuesta. Incube durante una hora a temperatura ambiente, protegido de la luz, agitando en un agitador para placas de ensayo.

Luego, agregue 50 microlitros de cada uno de los cuatro anticuerpos de detección a cuatro pocillos, dos de los cuales son pocillos de fondo y dos de los cuales son pocillos de respuesta. Incube durante 30 minutos en las mismas condiciones tras la adición de 50 microlitros del reactivo SAPE a todos los pocillos. Incube nuevamente durante 15 minutos en las mismas condiciones.

Coloque la placa sobre un separador magnético durante un minuto. Luego, retire el líquido invirtiendo con fuerza la placa mientras está sobre el separador, por encima de un recipiente de desecho. Pipetee 100 microlitros de tampón de ensayo en cada uno de los 16 pocillos.

Luego, retire el líquido de las perlas utilizando separación magnética. A continuación, agregue 100 microlitros de tampón de ensayo a cada uno de los 16 pozos. Lea la placa con el instrumento Luminex mag picks, consultando el manual del usuario para su correcto funcionamiento.

Seleccione un par de anticuerpos que cumpla con la intensidad de señal deseada. Después de seleccionar el mejor anticuerpo de captura, diluya 100 microlitros del anticuerpo acoplado al stock de perlas en 10 mililitros con tampón de ensayo. Añada 50 microlitros de las perlas diluidas a 78 pocillos de dos placas de 96 pocillos de fondo redondo CoStar.

Cada placa se utilizará para evaluar el rendimiento de un anticuerpo de detección diferente. A continuación, prepare una curva patrón de 12 puntos que comience en 8.000 picogramos por mililitro y finalice en cuatro picogramos por mililitro. Con los sistemas r y d.

Añada seis réplicas de 50 microlitros de cada dilución del estándar de TNF alfa a cada una de las placas, más seis pocillos con 50 microlitros de tampón de ensayo cada uno como fondo, para un total de 78 pocillos por placa. Incube las placas durante una hora a temperatura ambiente, protegidas de la luz y agitando en un agitador para placas de ensayo. A continuación, añada 50 microlitros del primer anticuerpo de detección a los 78 pocillos de la primera placa.

Repita el procedimiento para el segundo anticuerpo de detección en la segunda placa. Incube las placas durante 30 minutos en las mismas condiciones. Luego, agregue 50 microlitros del reactivo SAPE a todos los pocillos de cada placa.

Después de agitar las dos placas durante 15 minutos protegidas de la luz, coloque las placas sobre separadores magnéticos durante un minuto. Elimine el líquido invirtiendo con fuerza la placa mientras está sobre el separador, encima de un recipiente de desecho. A continuación, pipetee 100 microlitros de tampón de ensayo en cada uno de los 78 pozos de las placas antes de eliminar el líquido de las perlas magnéticas como se hizo anteriormente.

Tras agregar cien microlitros de tampón de ensayo a las perlas en cada uno de los 78 pozos de las placas, analice las placas en el instrumento mag picks consultando el manual del usuario para su correcto funcionamiento. Siguiendo las instrucciones incluidas con el kit ELISA DUOset de TNF alfa humano TNFSF1A de R&D Systems, mida la respuesta generada por el estándar proporcionado con el kit de R&D.

Repita el ensayo ELI a tres veces más, sustituyendo los anticuerpos de captura y detección de los sistemas r y d por los anticuerpos de los otros proveedores. Por simplicidad, empareje los anticuerpos según su proveedor y evalúe cada par independientemente según exija el formato EISA con cada uno de los tres estándares de proteína TNF alfa. Los ensayos Luminex Xap se realizaron como un multiplex para evaluar los cuatro anticuerpos de captura como una mezcla, combinando cuatro conjuntos de anticuerpos anti-TNF alfa acoplados a microesferas Mag PLX; los anticuerpos de captura se evaluaron con cada uno de los cuatro anticuerpos de detección biotinilados individualmente, de modo que se pudiera determinar simultáneamente la interacción de un anticuerpo de detección con cada uno de los cuatro anticuerpos de captura.

Los resultados indicaron que el par de anticuerpos del conjunto DUO de los sistemas r y d tuvo el mejor desempeño, con una respuesta resultante de 6.183 unidades de intensidad de fluorescencia mediana o MFI. También se observó que los anticuerpos de detección de Millipore y ABAM proporcionaron una respuesta razonable en el ensayo XAP cuando se combinaron con el anticuerpo de captura del sistema RD; los anticuerpos de captura de Millipore, ACAM y Novus produjeron una respuesta menos deseable en el ensayo XAP. Se utilizó el protocolo del conjunto DUO de los sistemas r y d para comparar los cuatro pares de anticuerpos en un formato EISA.

Se utilizó el protocolo de los sistemas r y d con todos los pares de anticuerpos porque refleja los protocolos típicos de EIA ampliamente utilizados en la actualidad, y es análogo a los protocolos empleados con la tecnología xap. Las pruebas de EISA mostraron que el par de anticuerpos de los sistemas r y d volvió a dar los mejores resultados. El par de anticuerpos de Acam no produjo ninguna respuesta, y los pares de anticuerpos de Millipore y Novas produjeron respuestas modestas con el fin de evaluar cualquier variación en la reactividad de los anticuerpos.

Con el estándar, se probaron los cuatro pares de anticuerpos con tres proteínas estándar recombinantes de TNF alfa procedentes de tres proveedores diferentes. Los datos muestran que las proteínas estándar recombinantes de TNF alfa de los tres proveedores produjeron resultados equivalentes. La proteína de TNF alfa de los sistemas r y d se utilizó para generar curvas estándar con los ensayos ELSA y XAP.

Aunque el ensayo ELI A se realizó con el par de anticuerpos de r and d system, los ensayos xap utilizaron el anticuerpo de captura de r and d system y bien el anticuerpo de detección de r and d systems o de Millipore. La proteína TNF alfa de r and d systems se diluyó para producir una serie de concentraciones que iban desde 8.000 hasta cuatro picogramos por mililitro únicamente. El par de anticuerpos de r and d systems produjo el resultado esperado en el ensayo Xap, con una respuesta superior a 20.000 MFI, tal como se muestra.

Cuando el anticuerpo de detección de Millipore se utilizó con el ensayo Xap en lugar del anticuerpo de detección de los sistemas r y d, la respuesta fue aproximadamente del 30 % de la respuesta obtenida con el anticuerpo de detección de los sistemas RD. La línea verde en este gráfico representa la curva patrón del ELA, que tenía un rango recomendado por el fabricante para el TNF alfa de 16 a 1000 picogramos por mililitro. Debido al límite del espectrofotómetro, no fue posible aumentar el rango del ensayo Eliza.

Además, el rango dinámico y la sensibilidad de ambos métodos se ilustran mejor cuando se representan en una escala logarítmica. Puede observarse una clara distinción entre la pendiente de la respuesta del EISA y las respuestas de los ensayos xap, lo que indica aún más una capacidad más limitada para la detección del TNF alfa con el EL iza tanto en concentraciones más altas como más bajas. Los límites de detección o LOD para los dos ensayos funcionales xap del TNF alfa se aproximaron identificando la concentración más baja de TNF alfa con un nivel de respuesta observado mayor que el fondo, más tres veces su desviación estándar o SD a partir de seis réplicas.

Aquí se puede observar que al utilizar el par de sistemas r y d, la concentración más baja de TNF alfa de 3,91 picogramos por mililitro produjo una respuesta de 66 MFI, lo cual es mayor que la respuesta correspondiente al fondo más tres desviaciones estándar cumpliendo este criterio. Cuando se utilizó el anticuerpo de detección Millipore junto con el anticuerpo de captura de los sistemas r y d, el límite de detección fue inferior a 7,81 picogramos por mililitro.

En este caso, la segunda concentración más baja de TNF alfa produjo una respuesta aceptable de 17 MFI, superior a la respuesta de la concentración más baja de TNF alfa más tres veces su desviación estándar. De manera similar, se estimó que el límite de detección para el conjunto dúo de sistemas r y d en el ensayo Eliza estaba entre 63 y 31 picogramos por mililitro. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros pasos como pruebas, diversas matrices de muestras o concentraciones de anticuerpo en el sistema de detección, con el fin de optimizar aún más el ensayo xap.