El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Para analizar los mecanismos celulares de internalización de nanopartículas y bacterias mediante citometría de flujo con imágenes multiespectrales. Primero, los macrófagos se tratan previamente con citocalasina D para inhibir la polimerización de actina. Se añaden nanopartículas o Salmonella al macrófago en monocapa y se incuba.

Luego se cosechan los macrófagos, se fijan y se marcan para su análisis mediante un sistema de imágenes en flujo. Las células analizadas por citometría de flujo de imágenes multiespectrales que han internalizado nanopartículas y/o salmonela se distinguen de aquellas con nanopartículas y/o salmonela unidas a la superficie. Los datos resultantes indican que tanto la salmonela como las nanopartículas son internalizadas únicamente por células que no han sido tratadas con citocalasina.

D lo que sugiere que la internalización depende de la actina. Esta técnica tiene varias ventajas sobre los métodos existentes, como la citometría de flujo y la microscopía confocal. Principalmente, proporciona una medida precisa de las intensidades de la señal fluorescente y de la resolución espacial entre diferentes características celulares a alta velocidad.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave tanto en la investigación de biomateriales para vacunas y entrega de fármacos, como en estudios sobre la interacción huésped-patógeno. Esto incluye delimitar las vías de internalización utilizadas por las nanopartículas de polianhídrido y las bacterias. Por lo general, las personas nuevas en este método suelen tener dificultades.

Es importante dedicar tiempo a titular los colorantes para obtener señales de fluorescencia óptimas. Además, familiarizarse con el software y crear plantillas de análisis requiere tiempo. Tuvimos la idea inicial de este método cuando descubrimos que las nanopartículas de polihidro exhiben características que imitan patógenos mientras empleábamos microscopía y otras técnicas.

Luego deseábamos un sistema de alto rendimiento para comparar los procesos de internalización utilizados por Salmonella y las nanopartículas de hidruro de polen antes de realizar el ensayo. Todas las culturas celulares bacterianas y de mamífero deben cosecharse y las suspensiones de nanopartículas deben prepararse. Comience por cosechar células RA W2 64.7 confluentes utilizando un raspador celular.

Determine el número de células utilizando un hemocitómetro. A continuación, siembre las células en una placa de cultivo de 24 pocillos a una densidad de cinco por 10 a la quinta células por pocillo en 0,5 mililitros. Incube durante la noche en DMEM completo a 37 grados Celsius en un incubador con 5% CO₂.

Para preparar la dilución de Salmonella Tarica, transforme Salmonella en C-D-M-E-M para obtener una multiplicidad de infección de cien por células RAW264.7 en un tubo de cultivo de vidrio de 16 por 125 milímetros con tapón de rosca y autoclave. A continuación, utilizando papel de aluminio esterilizado, pese cinco miligramos de nanopartículas de polianhídrido cargadas con FITC al 1%, generadas según lo descrito por Rean y colaboradores en su publicación de 2009 en Pharmaceutical Research, en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Añada las nanopartículas a 0,5 mililitros de solución salina tamponada con fosfato fría y coloque en hielo.

Mantenga el tubo en hielo. Utilice un procesador ultrasónico de líquidos con una micropunta para sonicar la suspensión durante aproximadamente 25 segundos a cuatro o seis julios. Ahora que todas las células y reactivos necesarios están listos, se puede realizar el ensayo de fagocitosis.

Etiquete placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos que contengan células RA W2 64.7 cultivadas, en preparación para el ensayo en la primera placa. Cada una de las siguientes muestras se ensayará por triplicado: citocalasina D con nanopartículas, citocalasina D con salmonela, medio con nanopartículas, medio con nanopartículas de salmonela únicamente, salmonela únicamente, y células teñidas solo con AF646 como controles a cuatro grados Celsius, que se ensayarán en la segunda placa e incluirán medio más nanopartículas y medio más salmonela, incubados a esta baja temperatura para ralentizar procesos celulares como la fagocitosis. Una hora antes de la inducción, agregue cinco microgramos por mililitro de citocalasina D y C-D-M-E-M a los pocillos adecuados e incube las células a 37 grados Celsius.

Después de la incubación, vortexe la suspensión de nanopartículas y añada 10 microlitros a los pozos correspondientes. Luego, vortexe la salmonela y añádala a los pozos correspondientes a una MOI de 100. Toque ligeramente la placa varias veces para mezclar.

Luego, coloque las placas de muestra a 37 grados Celsius y las placas de control negativo a cuatro grados Celsius durante 45 minutos. Tras la incubación, coloque las placas sobre hielo, lave las células dos veces con PBS frío sin calcio y magnesio mediante aspiración y descarte del medio antiguo para eliminar partículas no unidas, salmonela y células muertas o desprendidas. Uso de magnesio en pétalo.

El prelavado con PBS en esta etapa es esencial porque facilita la separación de las células del sustrato. Para recolectar las células, agregue 250 microlitros de PBS frío con hielo y raspe suavemente las pocilas; aspire con pipeta las células recolectadas hacia tubos de microcentrífuga siliconados con tapa de rosca, y manténgalos en hielo. Lave las células añadiendo un mililitro de tampón de lavado frío, luego centrifugue a 250 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Después de desechar el sobrenadante, elimine el tampón residual golpeando suavemente el tubo de microcentrífuga invertido sobre papel.

Resuspenda el pellet celular moviendo suavemente el tubo de microcentrifugado a través de una gradilla para tubos de ensayo. Para fijar las células, añada 100 microlitros de paraformaldehído al 4 % en PBS y deje reposar las células durante 15 minutos. A temperatura ambiente, lave las células añadiendo un mililitro de tampón de permeabilización y lavado, luego centrifugue a 250 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

Después de descartar el sobrenadante, elimine el tampón residual como antes. Luego, tiña las células RAW 264.7. Para la actina, agregue 100 microlitros de tampón de permeabilización y lavado que contenga Alexa Fluor foid en seis 60 durante 15 minutos.

A temperatura ambiente, las muestras sin teñir deben incubarse con perm, tampón de lavado sin phin. Después de la tinción, lávese y centrífuguese las células nuevamente, luego resuspéndanse en 50 microlitros de PBS que contenga 1 %PFA y almacénsense en la oscuridad a cuatro grados Celsius hasta la adquisición. Encienda, image stream y lance.

Seleccione inspirar e inicializar la fluidica en el menú de archivos. Elija cargar plantilla predeterminada. En la galería de imágenes, en el menú ver, seleccione todo y presione ejecutar configuración para comenzar a adquirir imágenes de las perlas; si es necesario, ajuste el seguimiento del núcleo para centrar las imágenes lateralmente.

Seleccione el canal de campo claro y haga clic en establecer intensidad. Espere hasta que el coeficiente de variación de la velocidad de flujo sea consistentemente inferior al 0,2 %. En la pestaña de asistencia, haga clic en iniciar todo para ejecutar las calibraciones y pruebas, y verifique que todas se hayan completado satisfactoriamente en el software. Haga clic en cargar muestra.

Luego, cuando se indique, coloque el vial que contiene la muestra más brillante. Con todos los fluorocromos en el cargador de muestras, seleccione un aumento de 40 x. Una vez establecidos los parámetros del instrumento, no los cambie durante todo el experimento.

Encienda cada láser del experimento haciendo clic en los iconos de láser en el software y ajuste la potencia del láser para que cada fluorocromo tenga valores máximos de píxeles entre 104.000 cuentas, según se mide en los diagramas de dispersión. Para eliminar la recopilación de objetos no deseados, haga clic en la ventana del clasificador de células en el software. Luego, para recopilar únicamente datos de células, seleccione el canal uno del límite inferior para el campo claro y establezca el valor en 50 micrómetros; los objetos con área menor a 50 micrómetros se considerarán detritos y no serán adquiridos.

Seleccione los canales que se recopilarán haciendo clic en los iconos de canal correspondientes en el software aquí. Los canales 1, 2, 3, 4, 5 y seis están seleccionados en la pestaña de configuración. Ingrese el número de archivo y la carpeta de destino.

Establezca el número de secuencia en uno y el número de eventos a adquirir en 5 000. Haga clic en ejecutar, adquiera para recolectar y guardar el primer archivo de datos del experimento. Haga clic en FLL y ejecute la siguiente muestra experimental.

Repita hasta que se hayan recolectado todas las muestras experimentales. A continuación, para ejecutar los controles, haga clic en configuración de compensación. Esto desactivará el campo brillante y el láser de dispersión y permitirá la recolección de todos los canales de fluorescencia en la pestaña de adquisición.

Cambie el valor de entrada a 500. Luego coloque el tubo de control y haga clic en ejecutar. Adquiera para recolectar 500 células positivas en los controles teñidos individualmente.

Repita el procedimiento para cada fluorocromo en el experimento con el fin de desarrollar una matriz de compensación. Una vez que se hayan adquirido todas las imágenes de la muestra, inicie el software de análisis ideas en un ordenador de análisis separado haciendo doble clic en el icono de ideas en el escritorio. Haga doble clic en el asistente de internalización y cargue uno de los archivos RIF de la muestra de prueba.

Una ventana emergente proporcionará instrucciones para cargar los archivos de prueba. Siga las instrucciones y haga clic en el botón siguiente. A continuación, haga clic en nueva matriz.

Esto iniciará el asistente de compensación. Cuando se solicite, seleccione los archivos de datos para los controles de color único a fin de agregarlos. Haga clic en siguiente dentro del asistente siguiendo las instrucciones hasta que el archivo de matriz de compensación se guarde y cargue en el cuadro en el paso dos del asistente de internalización.

Haga clic en siguiente y siga las instrucciones hasta que se genere un archivo DAF. Establezca las propiedades de visualización de la imagen seleccionando los canales de imagen utilizados durante la adquisición. Haga clic en el canal dos para FITC y en el canal cinco para AF 606.

El campo claro y la dispersión lateral se seleccionan por defecto. Seleccione el canal de campo claro O1 para delimitar el contorno celular y el canal O2 en el que se recolectaron las nanopartículas o bacterias para la sonda de internalización, con el fin de definir la población de células individuales; se genera un diagrama de dispersión del área de campo claro frente a la relación de aspecto de campo claro de todas las células. El análisis de alto rendimiento de múltiples archivos de datos requiere un archivo plantilla, por lo que es de vital importancia definir cuidadosamente las puertas al crear dicho archivo plantilla.

Cada punto representa los valores de una imagen individual de célula. Haga clic en un punto de un gráfico para seleccionar la imagen de esa célula particular en la galería de imágenes.

A continuación, dibuje una compuerta alrededor de las células con el área y la relación de aspecto que corresponden a eventos de célula individual. Las células individuales tienen una relación de aspecto de aproximadamente uno, y los dobletes tienen una relación de aspecto de alrededor de 0.5.

Haga clic en múltiples celdas para diferenciar la región que contiene celdas individuales frente a dobletes o detritos. Para generar un histograma de la raíz cuadrada media del gradiente de la imagen de campo claro. Haga clic en el botón siguiente.

Luego, en la pestaña de población, seleccione la opción de contenedor para mostrar el contenedor seleccionado. Haga clic en los contenedores para determinar la ubicación de las células y el mejor enfoque. Comience y dibuje una región lineal para guiar las células enfocadas.

Cuanto mayor sea el RMS del gradiente, mejor enfocada estará la muestra; omita el siguiente paso a menos que haya otras tinciones en las que basar el análisis. Se genera un nuevo diagrama de dispersión con la intensidad del canal dos en el eje X frente al valor máximo del píxel del canal dos en el eje Y. Haga clic en los puntos y visualice las imágenes para ayudarse a determinar la región que debe dibujarse alrededor de las células positivas para nanopartículas o bacterias.

Se genera un histograma de la característica de internalización con una región que comienza en cero, lo cual debe ajustarse observando las imágenes. La característica de internalización es una relación entre la intensidad dentro de la célula y la intensidad de toda la célula. Está escalada de tal manera que, en un valor de cero, la mitad de la intensidad se encuentra en el interior.

El asistente ha creado una región de cada célula que designa el interior mediante la elaboración de una máscara que se utiliza, la imagen de entrada de la célula para encontrar la superficie celular y se erosionó esta en cuatro píxeles. Tenga en cuenta que esta máscara puede ajustarse manualmente para diferentes tipos de células cuando sea necesario, creando primero una máscara de objetos en la imagen de campo claro y erosionando esta en más o menos píxeles. La característica de internalización se calcula a partir de esta máscara de objetos erosionada utilizando un algoritmo en el software.

Esta característica nos permite distinguir partículas y bacterias internalizadas, que tienen la mayor parte de su señal fluorescente dentro del límite de la máscara, de las partículas y bacterias unidas a la superficie, que tienen la mayor parte de su señal fluorescente fuera del límite de la máscara, como se muestra en este ejemplo. Cree un nuevo histograma con una nueva característica de internalización basada en la máscara de objeto erosionada. Dibuje una región para establecer una compuerta sobre las células internalizadas visualizando la imagen en el modo de bin seleccionado. Establezca la compuerta en 0,3 aquí.

Las células con una puntuación inferior a 0,3 se consideran células positivas para partículas unidas a la superficie. Para eliminar las células con marcado de fondo e identificar nanopartículas o bacterias internizadas específicamente, seleccione características en el menú de análisis. Haga clic en el menú de análisis.

Luego, haga clic en la función de recuento de colonias junto a agregar el recuento medio de colonias al informe de estadísticas. En el menú de informes, haga clic en el ícono de informes. A continuación, defina el informe de estadísticas, luego agregue columnas y finalmente seleccione la población celular adecuada.

Haga clic en aceptar. El asistente de internalización agregará automáticamente estadísticas a este informe para guardar el archivo de datos como archivo de plantilla que se utilizará para el análisis por lotes de todos los archivos experimentales. Haga clic en el menú archivo y seleccione guardar como plantilla.

Archivos de plantilla. Tienen la extensión dot AST para analizar múltiples archivos de datos en el software idea. Haga clic en herramientas y seleccione archivos de datos por lotes e ingrese todos los archivos RIF.

Agregue el archivo de matriz de compensación y el archivo de plantilla en las secciones correspondientes para enviar el lote para su procesamiento; haga clic en enviar. Después del paso de procesamiento, se analizan todos los archivos RAF y se generan archivos DAF para cada uno de los archivos sin procesar individuales. Se genera un informe final con estadísticas para todas las muestras a fin de comparar el efecto de la inhibición de la actina y de la baja temperatura sobre la fagocitosis de salmonela y nanopartículas.

Las células RA W2 64.7 se incubaron a 37 grados Celsius en medio, con o sin citocalasina D, o se incubaron en medio a cuatro grados Celsius. Tanto la temperatura como las manipulaciones del actin redujeron la internalización de ambas nanopartículas y Salmonella. Sin embargo, incubar las células con citocalasina D aumentó el porcentaje de células con nanopartículas unidas a la superficie, mientras que disminuyó el porcentaje de células con Salmonella unida a la superficie.

El porcentaje de células positivas para nanopartículas unidas a la superficie aumenta de aproximadamente el 8 % a 37 grados Celsius a más del 35 % tras el tratamiento con citocalasina D o a cuatro grados Celsius. En contraste, el porcentaje de células con Salmonella unida a la superficie se redujo del 35 % al 15 % tras el tratamiento con citocalasina D. La incubación de células RAW264.7 con Salmonella a cuatro grados Celsius disminuyó la internalización sin un aumento aparente en la cantidad de bacterias unidas a la superficie en comparación con el control a 37 grados Celsius. En conjunto, estos datos demuestran que Salmonella y las nanopartículas son internalizadas mediante un proceso celular similar que requiere actina y es dependiente de la temperatura.

Además, los datos indican que la unión sostenida de salmonela a los macrófagos requiere la polimerización de actina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo examinar la internalización celular de nanopartículas y bacterias mediante citometría de flujo de imágenes multiespectrales. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los inhibidores son citotóxicos.

Por lo tanto, son necesarios experimentos previos de perfilado de citotoxicidad para determinar las concentraciones óptimas a utilizar. No olvide que trabajar con Salmonella puede ser peligroso; se deben tomar precauciones, como usar el equipo de protección personal adecuado y evitar la creación de aerosoles, al realizar este procedimiento.