Un método paso a paso para la reconstitución de un transportador ABC en partículas lipídicas Nanodisc

El objetivo general de este procedimiento es incorporar un transportador A, b, C. En este caso, el transportador de maltosa malf GK dos en partículas solubles de nanodiscos de membrana. Esto se logra primero mezclando la proteína de andamio de membrana MSP, con el transportador y la cantidad correcta de lípidos en micelas de detergente.

El segundo paso consiste en agregar perlas de poliestireno y agitar suavemente la mezcla durante la noche; el detergente se absorbe progresivamente sobre las perlas, lo que permite la formación de las partículas de nanodiscos. A continuación, las perlas se eliminan por sedimentación. El paso final es separar los discos correctamente formados de los agregados y de las proteínas andamio no ensambladas mediante cromatografía de filtración en gel.

Finalmente, la calidad de los discos se evalúa mediante electroforesis en gel nativo o espectroscopía de dispersión de luz. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos como los liposomas es que las proteínas de membrana y los discos son perfectamente solubles en solución acuosa. Además, los dominios proteicos ahora son accesibles desde ambos lados.

Dado que ahora ya no existe un compartimento de membrana, utilizando proteínas de andamiaje de membrana de diferentes longitudes, pude atrapar y estudiar los diferentes estados conformacionales de las proteínas de membrana. Lo más importante es que este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del proteómica de membrana, como la identificación de nuevos socios de unión de los transportadores a, b, C. De hecho, las implicaciones de esta técnica se extienden aún más hacia la terapia, ya que pueden ayudar al descubrimiento de activadores o inhibidores de proteínas y receptores de membrana.

Aunque este método parece sencillo, debe tenerse precaución al elegir la proporción correcta de proteínas y lípidos. Por lo general, las personas nuevas en este método tienen dificultades para calcular la proporción molar correcta o para realizar los controles adecuados que aseguren la calidad de la preparación. Por lo tanto, una demostración visual de este método es muy útil para que un estudiante principiante aprenda los diversos pasos y las dificultades potenciales.

Para comenzar, exprese la MSP con etiqueta de hexa-histidina en la cepa de E. coli BL21(DE3) a partir del plásmido pMSSP1D. Induzca la producción de proteína cuando la densidad óptica medida a 600 nanómetros sea aproximadamente 0,5 durante tres horas a 37 grados Celsius. Recoga las células mediante centrifugación a 5.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Re suspenda el precipitado en tampón TSG10 que contiene 100 micromolares de PMSF. Lice las células con una prensa francesa tres veces a 8.000 PSI. Elimine el material insoluble mediante centrifugación a 5.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, aísle la fracción soluble que contiene la MSP mediante ultracentrifugación a 125.000 ×g durante 45 minutos.

Purifique la MSP mediante cromatografía de afinidad al níquel utilizando aproximadamente 1.5 mililitros de níquel seros de alto rendimiento en tampón TSG 10. Lave los contaminantes con tampón TSG 10 que contiene 50 milimolares de ILE. Eluya la MSP con tampón TSG 10 que contiene 600 milimolares de I midaz tras la diálisis.

La proteína purificada en el tampón TSG 10 MSP se puede almacenar a menos 70 grados Celsius y una concentración de proteína de aproximadamente 10 a 15 miligramos por mililitro. El complejo MALF GK dos, con etiqueta His en el extremo C de MAL K, se expresa a partir del plásmido. PED 22 FG K cultivado en la cepa de E. coli BL 21 DE tres, induce la producción de proteína cuando la densidad óptica medida a 600 nanómetros es de aproximadamente 0,5 con 0,2 %L Arabos durante tres horas a 37 grados Celsius tras la lisis celular y la centrifugación.

Como antes, suspendemos el sedimento de membrana en tampón TSG 20 hasta una concentración final de cinco miligramos por mililitro. A continuación, solubilizamos el material con GDM al 1% peso por volumen durante tres horas a cuatro grados Celsius con agitación suave. Eliminamos el material insoluble mediante ultracentrifugación, como en la purificación de MAL FTK dos.

Luego, recoja el sobrenadante que contiene el complejo mal FTK dos solubilizado y vuelva a purificar mediante cromatografía de afinidad con níquel. Purifique aún más el complejo mediante cromatografía de filtración en gel en tampón TSGD, utilizando una columna SUEx 200, HR 10/300, a un flujo de 0,5 mililitros por minuto. Para preparar los fosfolípidos, separe un extracto total de lípidos de e coli disuelto en cloroformo en alícuotas de 1000 anomal en tubos microficha con tapón de rosca, evapore el disolvente con una corriente suave de nitrógeno y deje secar durante la noche en vacío.

Desecar a continuación, disolver la película lipídica en tampón TS a una concentración final de cinco NMO y mezclar en vórtex vigorosamente, luego sonicar en pulsos cinco veces durante aproximadamente cinco segundos. Los lípidos disueltos aparecerán ligeramente opacos debido a su baja solubilidad general en tampón TS acuoso, pero deben permanecer en suspensión. Añadir DDM hasta alcanzar una concentración final de 0,5 %. En este punto, la solución se volverá transparente; colocar la mezcla lipídica en un baño de agua y sonicar en pulsos cinco veces durante aproximadamente cinco segundos.

La mezcla de lípidos puede almacenarse a cuatro grados Celsius durante un máximo de una semana. Para preparar las perlas bio, coloque aproximadamente de 10 a 15 mililitros de perlas bio en un tubo de 50 mililitros. Primero, lave las perlas con 50 mililitros de metanol al 100 %.

Deje que los perlas sedimenten por gravedad y luego vierta cuidadosamente la solución. Repita el proceso una vez con metanol y luego dos veces con etanol al 95%, agua milli Q y finalmente tampón TS. Comience la constitución nano discreta diluyendo MSP en tampón TSGD hasta una concentración final de aproximadamente siete miligramos por mililitro o 0,3 milimolar.

Para garantizar un experimento exitoso, es importante elegir las proporciones correctas de lípidos y proteínas que se mezclarán. Mezcle aproximadamente dos M de complejo purificado malf GK dos a una relación de proteína a MS P a lípido de uno a tres a 60 en tampón TSGD, para un volumen final de 300 microlitros. Aquí, también se prepara una muestra con exceso de lípido en la relación de uno a tres a 400 como control negativo. Añada 50 microlitros de suspensión de bio perlas al tubo e incube la mezcla durante la noche en una mesa agitadora a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, sedimente las perlas por gravedad. Una vez que las perlas hayan sedimentado, aspire la solución a través de una punta estrecha para evitar tantas bio perlas como sea posible.

Elimine los grandes precipitados mediante ultracentrifugación a 100,000 ×g durante 20 minutos. A continuación, proceda a purificar los discos mediante cromatografía de filtración en gel, tal como se realizó previamente en el tampón TSG 10. Luego, inyecte un Eloqua en la misma columna de filtración en gel para evaluar la estabilidad del preparado.

Luego, reúna las fracciones que contienen los discos. La calidad de la preparación se evalúa mediante electroforesis en gel nativo. Analice un micromolar de nanodiscos para evaluar la calidad de la reconstitución.

También evalúe la unión de mal E al complejo mal ftk dos reconstituido en nanodiscos. Después de la electroforesis, tiña el gel con azul de Kumasi durante 10 minutos y detenga durante aproximadamente una hora. Para realizar dispersión dinámica de luz o DLS, primero purifique los nanodiscos mediante cromatografía de filtración en gel como antes, utilizando una columna SUEx 200 HR 10/300 a un flujo de 0,1 mililitros por minuto.

Agrupe las fracciones que contienen nanodiscos y concéntrelas hasta aproximadamente 10 miligramos por mililitro utilizando un filtro centrífugo AmCon. Luego, filtre la muestra dos veces. Realice el análisis mediante DLS usando un instrumento Dynapro Nano Star en una celda de cuarzo con volumen interno de un microlitro.

Utilizando el software dinámico para estimar el diámetro y el peso molecular de las partículas, determine la actividad de la aTPAs en dos nanodiscos reconstituidos con mal FTK mediante un ensayo colorimétrico. Primero, mezcle un micromolar de discos purificados y un milimolar de aTP con cantidades crecientes de mal e. Incube las muestras a 37 grados Celsius durante 20 minutos.

Luego, mida la liberación de fosfato inorgánico a 660 nanómetros. Compare la cantidad de fosfato liberado con una curva patrón generada con una solución patrón de fósforo. Los nanodiscos se purifican mediante cromatografía de filtración en gel.

El cromatograma muestra que la mayoría de los discos reconstituidos eluyen como un solo pico, mientras que los discos elaborados con exceso de lípidos eluyen en el volumen de exclusión y como una serie de picos amplios. La calidad de la preparación de discos se analiza además mediante electroforesis en gel nativo: los discos reconstituidos con una cantidad limitada de lípidos migran como una banda definida en el gel nativo, mientras que aquellos reconstituidos en presencia de un exceso de lípidos migran como manchas difusas. El análisis mediante DLS muestra que la población de discos es homogénea, con un radio promedio de 5,0 nanómetros. Según la aproximación de DLS, los discos reconstituidos tienen un peso molecular aparente de 215 kilodalton. Las muestras reconstituidas en presencia de exceso de lípidos muestran radios ampliamente distribuidos alrededor de los 100 nanómetros, lo cual es típico de muestras no homogéneas.

La actividad del complejo MAL FTK dos se evalúa midiendo la velocidad de hidrólisis de TP y la afinidad por sus socios de interacción, como la proteína fijadora de maltosa, MAL E, la proteína fijadora de maltosa. MAL E se une con alta afinidad al transportador MAL FTK dos mediante electroforesis en gel no desnaturalizante. Es posible detectar un complejo entre MAL E y MAL FTK dos; aquí se muestra la estimulación de la actividad MAL KA TPA por MAL E en función de la concentración de MAL E.

La elaboración del disco nano es relativamente sencilla, aunque pequeñas desviaciones de las condiciones óptimas pueden provocar agregación irreversible de proteínas; una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de dos días. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta la importancia de elegir una relación proteína-lípido adecuada, ya que un exceso de lípidos conducirá a la producción de partículas grandes, polidispersas y similares a liposomas. Por ello, es fundamental analizar cuidadosamente la calidad del material reconstituido utilizando técnicas distintas de la filtración en gel, como la espectroscopía de dispersión de luz, la ultracentrifugación analítica o, de forma más sencilla, la electroforesis nativa en gel.

Recuerde, el tipo de fosfolípido que incorpora el disco, así como el de la proteína de andamiaje de membrana, puede influir en la eficiencia de la reconstitución. Después de ver este video, esperamos que haya comprendido bien cómo generar discos nano solubles y homogéneos que contengan su proteína de membrana de interés. Buena suerte con sus experimentos.