Análisis Optimizado de la metilación del ADN y la expresión génica de áreas pequeñas, anatómicamente definidas del cerebro

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el ADN. Los cambios en la metilación del ADN y en la expresión génica tras el estrés en la primera infancia. Esto se logra primero sometiendo a crías recién nacidas de ratón a separación materna para inducir estrés en la primera infancia; como segundo paso, se obtienen las áreas cerebrales de interés, en este caso el PVN, mediante microdisección in situ, y se aíslan simultáneamente ADN y ARN a partir de un único troquel de tejido.

A continuación, el ADN obtenido se trata con sulfito y la región de interés se amplifica mediante PCR con bisulfito. Luego, esto se inserta en un vector y se transforma en bacterias. Las transformaciones exitosas se identifican mediante la expresión del marcador y el tamaño del fragmento de PCR.

Y por último, la secuenciación de bisulfito se utiliza para evaluar el estado de metilación. La principal ventaja de este procedimiento es que permite un análisis conveniente de la programación epigenética en respuesta a estímulos ambientales. Este método puede proporcionar información sobre la programación epigenética provocada por adversidades en la primera infancia.

También puede aplicarse a otros sistemas. Dondequiera que se analice la metilación y la expresión génica en un entorno altamente específico de tejido y donde la disponibilidad de tejido sea limitada para inducir estrés en la primera infancia. La separación materna se realiza en crías procedentes de hembras C 57 black six N preñadas con cronología controlada para provocar separación materna.

Transfiera cada camada a una jaula limpia calentada durante tres horas diarias desde el primer hasta el décimo día posnatal; deje a las crías de control sin estrés sin perturbar. Aparte de la separación de tres horas, todas las camadas permanecen con sus madres hasta el destete en el día posnatal 21. Luego, las crías se alojan en grupos homogéneos por sexo, de tres a cinco ratones por jaula, en condiciones estándar de alojamiento. Para iniciar la recolección de tejido cerebral, los cerebros de los ratones se extraen de los cráneos y se congelan inmediatamente en isopentano sobre hielo seco y se almacenan a menos 80 grados Celsius.

Cuando esté listo para recolectar los fragmentos de tejido, retire los cerebros del congelador a menos 80 grados y colóquelos sobre hielo seco. Comience por seccionar criogénicamente los cerebros en cortes coronales de 10 micrones de rostral a caudal. Monte los cortes sobre portaobjetos de vidrio super frosts y séquelos para la tinción con violeta de genciana.

Se pueden tomar diapositivas adicionales y almacenarlas a menos 20 grados para análisis posteriores, como hibridación in situ. Cuando esté listo para obtener los fragmentos, tiña las diapositivas con violeta cresta para identificar las estructuras cerebrales de interés. Luego, utilizando una aguja de perforación, obtenga fragmentos de 0,8 milímetros de las regiones de interés mediante microdisección in loco.

Los fragmentos deben almacenarse a menos 80 grados Celsius. Es de vital importancia que el microcorte se realice de manera estandarizada, ya que la expresión génica y la metilación son altamente específicas del tejido. Homogenice los fragmentos en 400 microlitros de tampón de tiocianato de guanidinio utilizando una pipeta y luego vortexee a temperatura ambiente.

A continuación, pase el lisado resultante a través de una jeringa de calibre 29. Repita varias veces hasta que el punzón ya no sea visible. Divida el lisado en partes iguales.

Uno para procesar ARN, que debe hacerse primero, y otro para procesar ADN, que puede almacenarse a temperatura ambiente hasta que se procese el ARN para la purificación de ARN con un décimo de volumen de acetato de sodio, un volumen de fenol acuoso y medio volumen de cloroformo:isoamil alcohol (24:1). Agitar vigorosamente la mezcla tras cada adición e incubar la mezcla final en hielo durante 10 minutos. Luego, centrifugar la mezcla.

Recolecte la fase acuosa y añádale un volumen igual de etanol al 70%. Utilizando un kit de columna de centrifugación para ARN, realice una digestión de ADN en columna y lave para luego eluir el ARN en 25 microlitros de agua.

Ahora purifique el ADN utilizando un protocolo de kit modificado para incluir la adición de una digestión con RNasa, y para calentar el tampón de elución y la columna de elución a 70 grados Celsius antes de su uso. Son suficientes 10 minutos a 70 grados Celsius para las columnas. Finalmente, utilice un espectrofotómetro para determinar las concentraciones de ADN y ARN.

Un troquelado típico del NPM produce aproximadamente 600 nanogramos de ADN y unos 400 nanogramos de ARN apartados, de los cuales unos 100 nanogramos de ARN se destinan al análisis de expresión génica mediante PCR cuantitativa antes de la amplificación mediante sulfito. Trate 200 nanogramos del ADN aislado con un kit disponible comercialmente para amplificar el ADN procedente de regiones metiladas. Encargue cebadores diseñados específicamente para ADN convertido con bisulfito. Un diseño óptimo de cebadores en la PCR con bisulfito es esencial, ya que la calidad y especificidad del amplicón de PCR determinan el éxito de los pasos siguientes.

Cuando lleguen los cebadores, determine su temperatura óptima y de hibridación mediante experimentos piloto. Utilice dos microlitros de ADN tratado con bisulfito como molde para cada mezcla de PCR de 25 microlitros.

Aumente la mezcla comenzando con una desnaturalización de seis minutos a 95 grados Celsius, seguida de 45 a 50 ciclos de amplificación antes de una elongación final de cinco minutos a 72 grados Celsius. Analice siete microlitros del producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa para verificar el tamaño del amplicón. Purifique el producto restante de PCR para la ligación posterior utilizando un kit de limpieza de PCR disponible comercialmente.

Si se obtienen productos de PCR no deseados, utilice la purificación en gel para aislar el producto de interés para este protocolo. Se emplea un kit comercial de clonación. La eficiencia de clonación depende críticamente del inserto.

Por lo tanto, si se obtienen repetidamente bajos números de clones recombinantes, pruebe con un vector de clonación diferente. Prepare una reacción de ligación de 10 microlitros con un microlitro de vector y tres microlitros de producto de PCR purificado. Mezcle la reacción mediante pipeteo e incúbele toda la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente.

Depure la reacción de ligación mediante precipitación clásica con etanol y transforme las bacterias con el producto. Añada un mililitro de medio SOB precalentado directamente después de la aplicación del pulso y transfiera las bacterias transformadas a un tubo de reacción. Después de recuperar las bacterias durante una hora a 37 grados Celsius, siembre 100 microlitros de cada suspensión en una placa de LB con ampicilina recubierta con IPTG.

Incube las placas durante la noche una vez que las colonias puedan ser seleccionadas. Prepare reacciones de PCR de colonia de 25 microlitros en una placa de 96 pocillos utilizando tres microlitros de cloruro de magnesio 2,5 milimolar en cada reacción. Seleccione los clones blancos positivos con la punta de una pipeta y transfiera a una mezcla de PCR con una simple inmersión.

Comience la PCR con un ciclo de desnaturalización de cuatro minutos. A continuación, realice 10 ciclos de amplificación con una temperatura de hibridación de 56 grados Celsius. Cada paso de estos ciclos dura 30 segundos.

Luego, disminuya la temperatura de recocido a 48 grados Celsius durante 30 ciclos adicionales de amplificación. Finalice con un ciclo de elongación de cinco minutos. Ahora, cargue cinco microlitros de cada producto en un gel de aros e identifique las reacciones que contienen el inserto de tamaño adecuado.

Utilice un kit disponible comercialmente para purificar los productos de PCR de interés, de modo que puedan ser secuenciados mediante la técnica de terminación con colorante (big dye terminator). En una placa de 96 pocillos, cargue los pocillos con tres microlitros de la mezcla maestra de reacción big DI, seguidos de dos microlitros del producto de PCR de colonia purificado. Ejecute la reacción en un termociclador comenzando con un minuto a 96 grados Celsius, seguido de 35 ciclos de 10 segundos a 96 grados Celsius, cinco segundos a 50 grados Celsius y cuatro minutos a 60 grados Celsius.

Después de finalizar la reacción de bisulfito, purifique la reacción utilizando una placa de purificación para reacciones de bisulfito. Después de obtener las secuencias, analícelas mediante la herramienta en línea big analyzer o la herramienta B-I-S-M-A para determinar el patrón de metilación de la región de ADN estudiada y obtener información sobre la influencia del estrés temprano en la vida o ELS en la expresión y el estado de metilación de VP. Se procesaron ratones C57BL/6 según el protocolo descrito; se microdisectaron el núcleo paraventricular y el núcleo supraóptico para aislar ADN, el ADN-RNA fue tratado con bisulfito, amplificado con cebadores específicos para el potenciador de VP y los productos de PCR fueron clonados y secuenciados, analizando al menos 20 clones recombinantes de cada ratón.

Se analizó la PCR para determinar las frecuencias de metilación de los CPG incluidos en el amplicón de PCR en tejido de la P-V-N-E-L-S, que indujo una hipometilación significativa en cuatro ubicaciones del potenciador de A VP, lo que sugiere una marca epigenética en esta región reguladora a través de experiencias en la primera infancia. En contraste con la PVN, la metilación del potenciador de A VP no se vio afectada por ELS en el SON, lo que ilustra la especificidad tisular del efecto epigenético en animales control. El estado de metilación del ADN en el CPG 10 se correlacionó negativamente con la expresión del gen VP, lo que indica un papel de la metilación del ADN en el ajuste fino de la expresión génica de VP. Tras seguir este procedimiento, otros métodos como la UPCR pueden realizarse fácilmente con el ARN aislado para responder preguntas adicionales, como los cambios en la expresión génica en el tejido analizado.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar los cambios en la metilación del ADN en respuesta a estímulos dependientes del entorno o de experiencias.