De alto rendimiento de síntesis de carbohidratos y funcionalización de nanopartículas polianhidrido

En este artículo en video, describimos un nuevo protocolo Hydro Put para la síntesis automatizada en fase solución de oligosacáridos y la funcionalización de nanopartículas de polianhídrido. Con estos agentes de direccionamiento basados en carbohidratos, primero se sintetizan moléculas de carbohidratos mediante un sistema automatizado que utiliza la síntesis en fase solución en lugar de sintetizadores en fase sólida. A continuación, los intermedios de oligosacáridos se purifican mediante extracción en fase sólida de florosil o FSPE.

Las moléculas de carbohidratos producidas se caracterizan mediante RMN y luego se unen a las nanopartículas de polianhídrido mediante conjugación por carbo IDE. Finalmente, las nanopartículas funcionalizadas con carbohidratos se caracterizan mediante espectroscopía de fotoelectrones de rayos X y un ensayo de ácido fenil sulfúrico hidrofóbico. En última instancia, utilizando la metodología de hidrofobicidad descrita aquí, se han obtenido las condiciones de reacción para optimizar la morfología de las nanopartículas y la densidad de carbohidratos en la superficie de las partículas.

La principal ventaja de este método frente a los métodos existentes, como la síntesis de oligosacáridos en fase sólida, es que en este enfoque utilizamos una cantidad considerablemente menor de bloques de construcción. En este método, normalmente empleamos de dos a tres equivalentes en lugar de 10 a 20 equivalentes. Concebimos por primera vez esta idea cuando demostramos la eficacia de los efectos superficiales, mediante la funcionalización de nanopartículas de polihidroxilado con carbohidratos para dirigirlos a receptores específicos en células presentadoras de antígenos. Posteriormente, deseamos diseñar un sistema de alto rendimiento que nos permitiera analizar múltiples parámetros involucrados en la fabricación y aplicación de estos nuevos vehículos.

La demostración visual de este método es fundamental porque el desarrollo de plataformas automatizadas para la síntesis de alto rendimiento de oligosacáridos y su unión a partículas poliméricas es un área novedosa de investigación que carece de abundante documentación disponible antes de la síntesis automatizada del ácido diano. Un donador de azúcar adecuadamente protegido, típicamente tri cloro acetamida, y un aceptor principalmente en Alcon, alcohol fluoro, se sintetizan en la mesa de trabajo y se preparan en cloro metano; también prepare trimetil sililo, trifluoro metanosulfonato en cloro metano, metanol al 80 % y metanol al 100 %. Asegúrese de que la humedad relativa en la habitación sea del 30 % o inferior en la cámara de automatización.

La alta humedad es perjudicial para las reacciones de glicosilación. Los siguientes pasos se realizan utilizando una plataforma de automatización. La primera glicosilación se lleva a cabo con el donador y el alcohol florista.

Una vez finalizado, la molécula de azúcar etiquetada con florist tag resultante se purifica mediante FSPE. A continuación, el grupo protector temporal se elimina con sodio, metóxido y metanol, y nuevamente, el producto se purifica por FSPE. Después de esto, el azúcar con florist tag se utiliza como aceptor y se acopla al mismo donador para obtener el disacárido, el cual se purifica mediante FSPE para comenzar.

Coloque los reactivos, incluyendo el donador, el aceptor y el promotor, agua con 80% de metanol, metanol al 100% y metóxido de sodio en la plataforma robótica, e inicie el programa. El brazo robótico extraerá primero el donador y luego el aceptor de los viales y los transferirá a un vial de reacción. A continuación, la mezcla de donador y aceptor se agitará durante 30 minutos.

Después de que hayan transcurrido 30 minutos, el brazo robótico transfiere el catalizador trimetilsililo trifluorometanosulfonato a la mezcla. A continuación, la solución se agita durante 30 minutos adicionales. Una vez finalizada la agitación, el programa se detiene.

Retire un alícuota de 10 microlitros para verificar si la reacción está completa mediante cromatografía en capa fina. Si la reacción está completa, no se observará la molécula aceptora. Si la reacción no está completa, el aceptor en la CCF aún será visible.

Si este es el caso, detenga el programa, restablezca el tiempo de glicosilación en aproximadamente 30 minutos y agregue un exceso del promotor trimetil sililo, trifluorometanosulfonato. Cuando la reacción esté completa, continúe con el siguiente paso. Una vez finalizada la reacción, el robot transfiere la mezcla de reacción a cartuchos FSPE que contienen gel de sílice modificado con C nueve F 17 para su purificación.

A continuación, los cartuchos se lavan con ocho mililitros de metanol al 80 %, seguidos de ocho mililitros de metanol al 100 %. Para eliminar la fracción no floris, se recoge el flujo que atraviesa en un vial para obtener el producto marcado como florist deseado. Si se requiere una purificación adicional, detenga el robot y retire los productos de reacción adecuados.

Dependiendo de la estructura, los donadores pueden ser extremadamente poco reactivos y algunas moléculas aceptoras de florantreno podrían quedar incluso después de agregar un promotor suficiente. En tal caso, la EFPE no será lo suficientemente eficiente para la purificación y se podrá realizar una purificación adicional mediante cromatografía en columna de gel de sílice después de que el brazo robótico dispense metóxido de sodio en el vial de reacción. Luego, la reacción se agita durante dos horas en la plataforma robótica; si no está completa según lo determinado por TLC, se debe prolongar el período de incubación aproximadamente una hora más.

Después de finalizar la reacción, el producto se purifica mediante FSPE como antes. A continuación, retire el producto de la reacción del robot y, en la bancada, sométalo a disolución en tolueno anhidro, seguida de evaporación para eliminar el agua residual. Una vez que la muestra esté seca, colóquela nuevamente en el robot y repita el mismo ciclo, incluyendo la purificación por glicosilación mediante FSPE.

La protección profunda del grupo protector temporal seguida de glicosilación se repite hasta obtener la longitud de cadena deseada para la molécula objetivo. Para desproteger el producto protegido obtenido a partir de la automatización, retire el vial del robot. Los pasos finales del procedimiento utilizan gas hidrógeno explosivo y deben realizarse fuera de la plataforma de automatización. En la mesa de trabajo, oz, ocurre la lisis del doble enlace en la etiqueta florista y se sigue con la oxidación del aldehído producido a ácido carboxílico.

Purifique el producto resultante mediante cromatografía en columna de gel de sílice en banco utilizando una mezcla de metanol al 30 % en diclorometano. Finalmente, para desproteger los grupos éter bencílico mediante hidrogenación catalizada por paladio, pase el producto a través de una almohadilla satélite para eliminar el paladio y obtener el producto final puro. Caracterice completamente el producto mediante resonancia magnética nuclear o espectroscopía de RMN.

La síntesis de polímeros con alta capacidad de lanzamiento y la fabricación de nanopartículas se llevan a cabo siguiendo el protocolo descrito por Peterson et al. Como se menciona en el documento adjunto, el aparato automatizado de deposición utilizado para la funcionalización de partículas consta de tres bombas ne 1000, una plataforma robótica integrada por dos actuadores, uno para el movimiento en la dirección X y otro para el movimiento en la dirección Y, y una segunda plataforma robótica con dos bastidores adyacentes que constan de tres actuadores, uno para cada dirección de las bombas, y un total de cinco actuadores conectados. Los actuadores y las bombas en serie son operados por una computadora utilizando software lab view.

Los sistemas de copolímeros utilizados para la fabricación de partículas se basan en ácido SEBA o SA y un seis bis, para-carboxi, oxil heano o CPH y un dieciocho bis para-carboxi fenoxi tres seis dioxano o CP Teeg. Tras la fabricación de las nanopartículas, coloque un estante que contenga los tubos de centrifugación de 1,7 mililitros con una biblioteca de nanopartículas en la etapa del actuador lineal para la unión de carbohidratos a la superficie de las partículas de polianhídrido, y se realiza una reacción de acoplamiento de ácido carboxílico medio que consta de dos reacciones consecutivas. Para la primera reacción, llene una jeringa en una bomba de jeringa programable con una solución acuosa de EDC y etilendiamina a una concentración de dos miligramos por miligramo de nanopartículas y 0,6 miligramos por miligramo de nanopartículas, respectivamente.

Llene una segunda jeringa en una bomba de jeringa programable con 2,5 miligramos por miligramo de partículas de NHSA, un total de 12 equivalentes por muestra de nanopartículas, en solución acuosa. A continuación, utilizando el programa LabVIEW, indique al robot que deposite suspensiones de reactivo en la biblioteca de nanopartículas. Los actuadores del robot moverán entonces el porta-tubos a la posición correcta en la plataforma para la dispensación de las soluciones, EDC y NHS.

Activee los grupos ácido carboxílico en la superficie de las nanopartículas de polianhídrido y permita un acoplamiento medio. A continuación, sumerja una sonda de sonicación en cada tubo y someta cada muestra a sonicación durante 30 segundos a 40 hercios. Antes de pasar a la siguiente muestra, limpie la sonda con acetona.

Una vez que todas las muestras están saturadas, se separa el portamuestras del platillo robótico. Incube las suspensiones de nanopartículas durante nueve horas con rotación constante a cuatro grados Celsius. Los tiempos de reacción para la primera y segunda reacción pueden modificarse para ajustar la concentración final de sacáridos.

Una vez finalizada la reacción, centrifugar los tubos a 12.000 × g durante cinco minutos. En un entorno frío, regresar a la estación robótica. Volver a colocar el portatubos en el brazo robótico y llenar la segunda jeringa en la plataforma robótica.

Con agua fría, la primera jeringa debe permanecer vacía. Inicie el robot. El sobrenadante en cada tubo se aspira hacia la jeringa vacía y la segunda bomba deposita agua fría en los tubos.

Este paso se realiza para eliminar cualquier reactivo no reactivo de las suspensiones de nanopartículas. A continuación, homogenice la suspensión de nanopartículas mediante sonicación, como se demostró anteriormente. Luego, centrifugue los tubos a 12.000 ×g durante cinco minutos.

Realice un segundo lavado con agua fría utilizando el aparato robótico para la segunda carga de reacción: coloque 12 equivalentes por muestra de nanopartículas de EDC en la primera bomba y 12 equivalentes por muestra de nanopartículas de NHS en la segunda bomba. Inicie la plataforma robótica para dispensar volúmenes adecuados en los tubos que contienen las nanopartículas. La presencia de EDC y NHS permitirá la formación de un enlace amida entre los grupos amina del dietileno ya unido a la superficie de la nanopartícula y el grupo ácido carboxílico del azúcar con protección profunda.

Una vez finalizada la deposición, cargue 10 equivalentes de un sacárido específico. En este caso, se utilizó lactosa y el control de ácido glicólico en las dos bombas disponibles. Cada sacárido se deposita en tubos de ensayo según la funcionalización deseada a obtener en cada tubo, lo cual se programó previamente en el programa de vista de laboratorio, utilizado para operar las funciones de los actuadores y las bombas para la reacción específica empleada. En este estudio, para la unión de carbohidratos, se utiliza el ácido glicólico como control de enlazador, ya que los sacáridos con protección profunda ya tienen esta molécula unida covalentemente, lo que permite su posterior fijación a la superficie de la nanopartícula.

Las suspensiones de nanopartículas se homogenizan mediante sonicación como antes y luego se incuban durante nueve horas con rotación constante a cuatro grados Celsius. Después de la incubación, lave las suspensiones de nanopartículas mediante centrifugación, retire el sobrenadante, luego resuspenda el sedimento en agua fría y sonicación. Coloque los tubos, que ahora contienen la biblioteca de nanopartículas funcionalizadas, en una cámara de vacío para secar durante al menos dos horas. Las nanopartículas funcionalizadas se caracterizan mediante dispersión dinámica de luz y otros métodos para evaluar la composición superficial, concentración, tamaño de partícula, distribución del tamaño y carga superficial.

El lado diano completamente protegido que se muestra aquí se sintetizó utilizando la plataforma de automatización. El compuesto sintetizado se caracterizó mediante resonancia magnética nuclear de protones en un espectrómetro VXR de 400 megahercios. Utilizando CDC 13 como disolvente, se puede confirmar la formación del producto a partir de la presencia de algunos picos característicos.

En el diagrama de RMN de protones, los cuatro protones entre 1,79 y 2,21 y los dos protones a 3,38 provienen de la etiqueta florist. El pico singlete a 2,16 corresponde al pico de acetato; los picos a 4,94 y 5,11 son los protones anómericos para evaluar el efecto del tiempo de reacción sobre la morfología final de las nanopartículas y el grado de unión del azúcar logrado. Las nanopartículas fueron funcionalizadas con tiempos crecientes de reacción, como se muestra aquí; la concentración de diano sobre la superficie de las nanopartículas 50 50 CPT CPH aumentó con el tiempo total de reacción y alcanzó un máximo tras 18 horas.

Las nanopartículas funcionalizadas con un tiempo total de reacción de 24 horas se utilizaron luego para evaluar su capacidad de dirigirse a los CLR en células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón mediante citometría de flujo, como se muestra aquí. Se observó un aumento en la expresión del receptor DC sign y del receptor manosa hacia receptores de tipo lectina C después de la estimulación con nanopartículas no funcionalizadas, así como con nanopartículas funcionalizadas con lactosa y DANO. Esto indica un direccionamiento efectivo.

Sin embargo, las partículas funcionalizadas con Diano mostraron un nivel más alto de expresión, lo que indica una especificidad de este ligando para los receptores que se estudiaron. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la síntesis automatizada de alto rendimiento de oligosacáridos, así como de la funcionalización de nanopartículas poliméricas. Utilizando estos agentes de direccionamiento basados en carbohidratos, una vez dominada la síntesis del azúcar protegido donador y aceptor, así como el montaje del aparato, el proceso puede completarse en un período de 24 a 48 horas.

Por supuesto, la duración depende del tamaño de la biblioteca así como del tiempo de funcionalización. Al seguir este método, es importante recordar que se pueden optimizar las condiciones de reacción para la funcionalización de partículas polihidroxialcanoato biodegradables según la química de la nanopartícula. Siguiendo este procedimiento, se pueden sintetizar diversas estructuras de carbohidratos con el fin de dirigirse a diferentes receptores celulares y así influir en la respuesta inmunológica.