Síntesis combinatoria y de alto rendimiento liberación de proteínas de película de polímero y nanopartículas Bibliotecas

Este vídeo describe la síntesis combinatoria de bibliotecas de películas y nanopartículas de polianhídrido biodegradable, y la detección de alto rendimiento de la liberación de proteínas a partir de estas bibliotecas. Primero, se utiliza un aparato automatizado de deposición de alto rendimiento para depositar una matriz diversa en composición de monómeros en cubetas de vidrio. Se lleva a cabo una reacción de policondensación a 180 grados Celsius y 0,3 torr durante 1,5 horas.

Estas condiciones de reacción son específicas para la síntesis del polímero anhídrido poli C-P-H-S-A. Mediante el uso del aparato de deposición automatizado, se depositan el disolvente y cualquier componente para encapsulación en las cubetas que contienen la biblioteca de polímeros. Puede aplicarse sonicación para asegurar la disolución completa del polímero y la dispersión uniforme de los componentes adicionales.

Luego, el polímero disuelto se transfiere a un tubo con un disolvente no solvente para fabricar la biblioteca de nanopartículas mediante nanoprecipitación. Las nanopartículas se recuperan mediante secado al vacío o filtración, y luego se transfieren a una placa modificada de 96 pocillos con liberación controlada. Finalmente, la biblioteca cargada con proteína se incuba en condiciones fisiológicas y se evalúan la cinética de liberación de proteína mediante un método de detección fluorescente por separación espacial.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la cinética de liberación de proteínas en función de las propiedades del polímero o de las condiciones del entorno de liberación. La principal ventaja de este enfoque frente a otras técnicas convencionales que analizan una muestra a la vez es que podemos sintetizar múltiples muestras simultáneamente. Estas muestras luego pueden analizarse mediante cribado de alto rendimiento para evaluar las interacciones proteína-polímero, célula-polímero o polímero-huésped.

Esto acelera entonces el diseño y desarrollo racional de estos biomateriales para la administración de fármacos e ingeniería de tejidos. La encargada de demostrar el procedimiento será La Tricia Peterson, una becaria posdoctoral de mi laboratorio. En esta sección del video, se utiliza un aparato de deposición de alto rendimiento Hyatt para depositar una biblioteca de monómeros con variación composicional tras la síntesis del polímero.

Este aparato se utiliza para fabricar una biblioteca combinatoria de películas poliméricas o nanopartículas, vacías o cargadas con proteínas. La plataforma automatizada consta de dos bombas de jeringa programables y tres actuadores lineales conectados en serie a una computadora. Se utiliza software LabVIEW para enviar comandos a las bombas de jeringa y a los actuadores.

Se cargan jeringas gast tight de 10 cc en las bombas de jeringa con tubos capilares de metal conectados mediante accesorios de bloqueo tipo lure lock, que dispensan las soluciones poliméricas en cubetas de vidrio. En esta demostración, se utilizará ácido seícico o SA junto con uno seis Biss para oxi heano o CPH para crear una biblioteca de nanopartículas que encapsulan albúmina sérica de bovino marcada con Texas Red. Las instrucciones de este video y los documentos adjuntos pueden adaptarse para fabricar y probar una amplia variedad de bibliotecas de películas poliméricas y nanopartículas.

Para sintetizar las bibliotecas, comience por disolver cada monómero y cloroformo a una concentración final de 25 miligramos por mililitro en un vial de vidrio. A continuación, cargue cada solución en una jeringa hermética de 10 cc aspirando la solución a través del extremo de bloqueo de acople de la jeringa. Elimine cualquier burbuja de aire.

A continuación, sujete el tubo capilar de acero inoxidable con cierre resistente al disolvente al extremo de la jeringa. Sujete los tubos capilares con pinzas y fíjelos a un soporte con anillo. Luego, coloque el extremo de ambos tubos capilares dentro del vete inicial.

Para la deposición del monómero. Coloque las jeringas en las bombas de jeringa programables y fíjelas en posición en el software de vista de laboratorio. Establezca los actuadores lineales en la posición inicial en el software.

Inicie la deposición automatizada de los monómeros de SA y CPH en las cubetas de vidrio a lo largo de los ejes x, y y Z. Los actuadores posicionarán correctamente los tubos capilares en cada Q, y bombearán volúmenes programados de cada monómero en ellos, creando una biblioteca de monómeros con variación composicional. Tras la deposición de los monómeros.

Transfiera la biblioteca de monómeros a un horno de vacío precalentado e incube a 180 grados Celsius y 0,3 torr durante 1,5 horas para permitir la polimerización por condensación. Tras la incubación, se completa la fabricación de la biblioteca de polímeros. A continuación, se generan nanopartículas poliméricas cargadas con proteína.

Consulte el protocolo adjunto para la fabricación de una biblioteca de películas poliméricas cargadas con proteína con el fin de fabricar una biblioteca de nanopartículas cargadas con proteína. Añada la proteína, en este caso albúmina sérica bovina marcada con rojo Texas, al disolvente adecuado, que debe ser capaz de disolver la biblioteca de polímeros. Aquí se utiliza cloruro de metileno en una concentración de dos miligramos por mililitro.

Llene la jeringa de 10 cc con BSA marcado con Texas Red que contiene disolvente y colóquela en la primera bomba de jeringa. Luego, coloque una jeringa limpia y vacía de dos cc en la segunda bomba de jeringa; coloque tubos que contengan 15 mililitros de un no disolvente, en este caso pentano, en el soporte de tubos adyacente a la plataforma de viales. A continuación, en el laboratorio, en el software, inicie el proceso automatizado de deposición de disolvente seleccionando el programa.

Tras la iniciación del programa, el disolvente se deposita en las cubetas que contienen la biblioteca de polímeros, obteniendo una concentración de polímero de 20 miligramos por mililitro. Cuando todo el disolvente haya sido depositado, déjelo disolver el polímero durante uno a cinco minutos. A continuación, realice una homogenización opcional para asegurar una completa disolución del polímero y una dispersión uniforme de la proteína.

A continuación, inicie el programa de transferencia de muestras en lab view. Cada muestra de polímero disuelto en la biblioteca se aspira luego en la jeringa vacía y se dispensa en el tubo correspondiente de disolvente no solvente en el portamuestras. Una vez que se ha transferido cada muestra, recupere las nanopartículas cargadas con proteína colocando la biblioteca de nanopartículas en una cámara de vacío a 10 milímetros de mercurio de vacío, o mediante filtración al vacío hasta que se elimine el disolvente.

Para investigar la liberación de BSA encapsulada, comience con una placa de polipropileno profunda de 96 pocillos que haya sido modificada mediante la eliminación de la mitad superior de cada pared de los pocillos en cada par de columnas adyacentes en la placa. La eliminación de la parte superior de cada pocillo entre las columnas A y B, C y D, E y F, y G y H permite el flujo de líquido entre cada par de pocillos adyacentes cuando se llenan hasta el volumen total de transferencia. Agregue estándares de BSA marcada con Texas Red en concentraciones que van desde 1000 hasta 10 microgramos por mililitro en la placa de 96 pocillos profunda.

Estos se utilizarán para calcular la cantidad de proteína y también tendrán en cuenta el apagado del fluorocromo. Reconstruya la masa deseada de nanopartículas en tampón PBS y luego sométalas a sonicación para dispersar uniformemente las partículas. A continuación, transfiera la biblioteca de nanopartículas a la placa de 96 pocillos profundos y espere hasta que las muestras se asienten en el fondo de la placa. Luego, utilizando una pipeta, llene lentamente todos los pocillos adyacentes con tampón PBS hasta un cuarto de pulgada desde la parte superior del pocillo.

Debe haber suficiente tampón en los pocillos adyacentes para que fluya libremente entre ellos. A continuación, selle la placa de liberación con la tapa y colóquela a 37 grados Celsius bajo agitación. Durante toda la duración del experimento, en puntos de tiempo incrementales, utilice un escáner fluorescente plano Typhoon 9 400 para escanear la placa utilizando los filtros adecuados de excitación, láser y emisión.

Tras la escaneado, utilice un software de cuantificación de imágenes para cuantificar la cantidad de proteína conjugada con fluorocromo liberada en cada muestra. En este caso, el BSA marcado con Texas Red se encapsuló en una biblioteca de nanopartículas poliméricas sintetizadas a partir de los monómeros SA y CPH, tal como se describe en este video, con el fin de determinar la cinética de liberación de proteínas en función de la química del polímero. Las nanopartículas cargadas con proteína se incubaron a 37 grados Celsius durante un mes, período durante el cual se obtuvieron escaneos fluorescentes en puntos temporales sucesivos para la cuantificación de la liberación de proteína.

Como se muestra aquí, este método de alto rendimiento se utilizó para determinar la cinética de liberación de BSA marcada con Texas Red a partir de una biblioteca de nanopartículas de polianhídrido A-C-P-H-S-A. Se observaron tendencias dependientes de la composición química, con tasas de liberación crecientes en las formulaciones de película de Sarich. Se obtuvieron resultados similares al utilizar ensayos estándar de cuantificación de proteínas.

En un experimento independiente, se evaluó la liberación de BSA marcada con Texas Red a partir de bibliotecas de películas de polianhídrido CPT CPH, tal como se muestra aquí; se observaron cinéticas de liberación cercanas al orden cero, con las películas ricas en cpeg liberando la proteína más rápidamente, lo que sugiere aplicaciones potenciales en el campo médico como dispositivos biodegradables de administración de fármacos. Estos resultados indican que el perfil de liberación deseado de un fármaco terapéutico o un antígeno vacunal puede controlarse modificando la química del polímero. Tras este procedimiento, se han desarrollado otros métodos combinatorios para investigar áreas como la estabilidad de proteínas, la toxicidad celular, la activación celular y la biodistribución InVivo.

Estos aspectos son importantes para el diseño racional de biomateriales para la administración de fármacos e ingeniería de tejidos. No olvide usar el EPP adecuado y practicar procedimientos de laboratorio seguros durante todo este protocolo.