Reacción en cadena: Protocolo Básico Plus Estrategias de resolución de problemas y optimización
22 de mayo de 2012
PCR se ha convertido en una técnica común en muchos laboratorios de biología molecular. Siempre que aquí hay una guía rápida de varios protocolos de PCR convencionales. Debido a que cada reacción es un experimento único, las condiciones óptimas requeridas para generar un producto variar. La comprensión de las variables en una reacción en gran medida mejorar la eficiencia de la solución de problemas, lo que aumenta la posibilidad de obtener el resultado deseado.
El objetivo general de este procedimiento es demostrar los pasos involucrados en la reacción en cadena de la polimerasa o PCR, que se utiliza para producir una cantidad abundante de un segmento específico de ADN a partir de una pequeña cantidad de material inicial. Primero, reúna los reactivos y materiales que se utilizarán en la reacción de PCR; luego, prepare la mezcla de reacción, que incluye los cuatro desoxirribonucleótidos, la plantilla de ADN, los cebadores y la ADN polimerasa. A continuación, programe las condiciones de ciclado térmico y realice la reacción de PCR.
Después de esto, revise los resultados para determinar si la reacción fue exitosa. En última instancia, una reacción en cadena de la polimerasa debería producir un amplicón específico del tamaño deseado del producto.
Por lo general, las personas nuevas en este protocolo tendrán un poco de dificultad al configurar los cálculos de cada uno de los reactivos variables, y a veces tendrán problemas con la pipeta, especialmente con los volúmenes correctos del polimerasa que contiene glicerol. Comience el experimento con un recipiente lleno recientemente de hielo. Use guantes para evitar contaminar la reacción.
Mezcla y reactivos. Coloque los componentes de la PCR en hielo para descongelarlos completamente. Estos incluyen la plantilla de ADN, los cebadores, la ADN polimerasa, tampón de reacción 10 x con o sin cloruro de magnesio, desoxinucleótidos, agua estéril y cloruro de magnesio.
Se requiere cloruro de magnesio si se utiliza el tampón sin cloruro de magnesio. Coloque una placa de 96 pocillos en un recipiente con hielo como soporte para los tubos PCR de pared delgada de 0,2 mililitros. Ahora equipe la bancada con tubos PCR y tapas.
Un portamatraces para tubos PCR, un marcador resistente al etanol y un juego de micropipetas. Cree siempre una tabla de reactivos detallando la mezcla de reacción con agua destilada estéril en cantidad suficiente para obtener un volumen final de 50 microlitros. Por ejemplo, utilizando cinco microlitros de un tampón sin magnesio, un microlitro de DNTPs 10 milimolares y magnesio optimizado a 4,0 milimolares.
Un microlitro de cada cebador de veinte micromolares, 0,5 microlitros de una plantilla de dos nanogramos por microlitro y 0,5 microlitros de polimerasa requerirían únicamente 33 microlitros de agua estéril. Añada cloruro de magnesio si no está presente en el tampón 10 x o si es necesario para la optimización de la PCR.
Proceda a etiquetar los tubos de PCR con un marcador resistente al etanol en cada tubo de reacción. Primero, agregue las cantidades calculadas de agua estéril, luego agregue tampón 10 x y DNTPs 10 milimolares. Para esta reacción, estamos realizando una titulación con cloruro de magnesio.
Dado que la concentración de magnesio no será constante, el cloruro de magnesio se añade individualmente a los tubos de PCR, y el volumen se normaliza a 10 microlitros con agua estéril, de modo que se añaden 40 microlitros de la mezcla maestra final a cada tubo de PCR. Para completar la reacción de 50 microlitros con cloruro de magnesio, continúe añadiendo la plantilla de ADN y los cebadores. Finalmente, añada de 0,5 a 2,5 unidades de ADN polimerasa por reacción de 50 microlitros en un tubo microfuga de 1,8 mililitros.
Prepare una solución de mezcla maestra suficiente para incluir los controles, así como para compensar las pérdidas durante la transferencia con pipeta. Ajuste una micropipeta a aproximadamente la mitad del volumen total de la solución y mezcle suavemente aspirando y dispensando con la pipeta. Para cada muestra de prueba, añada la mezcla maestra a un tubo de PCR.
Ahora, para el control negativo sin ADN molde, agregue todos los reactivos y use agua estéril para compensar el volumen de ADN faltante. Luego, para el control positivo, utilice un conjunto de ADN molde y cebadores que amplifiquen un fragmento conocido bajo las mismas condiciones que las muestras experimentales de PCR. Los termocicladores PCR calientan y enfrían rápidamente la mezcla de reacción, permitiendo la desnaturalización inducida por calor del dúplex, el apareamiento de los cebadores con las cadenas positiva y negativa del molde de ADN y la elongación del producto de PCR.
Los tiempos de ciclado se basan en el tamaño de la plantilla y en el contenido de GC del ADN según la fórmula general. Comience con una desnaturalización inicial de la plantilla, luego inicie de 25 a 35 ciclos de un programa de ciclo de temperatura en tres pasos. El primer paso de estos ciclos desnaturaliza la plantilla de ADN.
Luego programe, de forma óptima, un paso de alineamiento de cebadores aproximadamente cinco grados Celsius por debajo de la temperatura aparente de fusión de los cebadores, seguido por el paso de elongación para llevar la polimerasa a la plantilla de ADN y sintetizar el producto de PCR. Ahora ingrese el número de ciclos. Siguiente programa.
Un paso extendido de elongación para completar la síntesis de los amplicones. Finalmente, incluya un paso de terminación, enfriando la mezcla a cuatro grados Celsius. Si las condiciones estándar de PCR no producen el amplicón deseado, es necesario optimizar la PCR para obtener mejores resultados.
Entonces, si las reacciones no funcionaron la primera vez, querrá intentar solucionar el problema. Primero, debe asegurarse de que el problema no haya sido un error humano. Eso podría ocurrir si tuvo un error de pipeteo o si olvidó añadir un reactivo a la prueba, a uno de los tubos de ensayo.
A continuación, puede intentar modificar algunas de las rigurosidades de la condición, de modo que pueda ajustar la configuración del termociclador, o bien puede alterar la concentración de magnesio, que es otro método alternativo. También puede intentar agregar algunos aditivos al reactivo para solucionar los problemas. Alternativamente, considere la PCR con inicio en caliente como una modificación versátil en la que el tiempo de desnaturalización inicial se incrementa considerablemente.
Se utiliza entonces la electroforesis en gel AROS para separar el producto de PCR del gen tres GAL a partir de ADN genómico de S. seia con el fin de determinar la concentración óptima de iones de magnesio para este conjunto de reactivos. Obsérvese un producto de PCR del tamaño esperado: 2098 pares de bases, que aparece a partir de una concentración de magnesio de 2,5 milimolar, con una concentración óptima a 4 milimolar. En diferentes plantillas de ADN, la amplificación del producto de PCR deseado como una banda definida requiere 2 milimolar de magnesio. La reducción de la especificidad de la reacción, llevando las condiciones de amplificación a niveles efectivamente subóptimos, produce un borramiento de productos no específicos.
Además, con la reducción de la rigurosidad general de la reacción, se requiere una menor cantidad de ion magnesio para formar un icono de amplicón. Por lo tanto, optimizar la PCR teniendo en cuenta las variables puede producir el producto deseado específico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar y preparar una reacción en cadena de la polimerasa.
El objetivo es comprender las variables de cada PCR y cómo se pueden manipular para crear el amplicón deseado.
Descripción general
Este artículo proporciona una guía completa sobre la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), detallando los pasos necesarios para amplificar con éxito el ADN. Se destaca la importancia de comprender las variables de la reacción para solucionar problemas y optimizar los resultados de la PCR.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Molecular
- Genética
- Biotecnología
Antecedentes
- La PCR es un método ampliamente utilizado para la amplificación de ADN.
- Cada reacción de PCR es única y requiere condiciones específicas.
- Comprender los componentes y sus funciones es fundamental para el éxito.
- Los problemas comunes incluyen errores de pipeteo y cálculos de reactivos.
Objetivo del estudio
- Demostrar los pasos necesarios para preparar una reacción de PCR.
- Proporcionar consejos para solucionar problemas comunes en la PCR.
- Destacar la importancia de optimizar las condiciones de la reacción.
Métodos Utilizados
- Preparación de reactivos y materiales para PCR.
- Preparación de la mezcla de reacción con volúmenes precisos.
- Programación de las condiciones de ciclado térmico para la amplificación de ADN.
- Uso de la electroforesis en gel para analizar los productos de PCR.
Resultados principales
- Se logró la amplificación exitosa de segmentos de ADN.
- La optimización de la concentración de iones magnesio mejoró los resultados.
- Se identificaron estrategias comunes de resolución de problemas.
- Se demostró que la variabilidad en las condiciones de reacción afecta los resultados.
Conclusiones
- Comprender los componentes de la PCR es esencial para una resolución de problemas eficaz.
- La optimización de las condiciones puede mejorar significativamente el éxito de la PCR.
- Los experimentos futuros deben centrarse en perfeccionar las técnicas para obtener mejores resultados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es fundamental para el descubrimiento molecular, ya que permite la amplificación precisa de ADN a partir de una cantidad mínima de material inicial. La preparación robusta de la PCR, junto con la resolución de problemas y la optimización, afecta directamente la fiabilidad del ensayo, la validación del blanco y la reproducibilidad del flujo de trabajo posterior en la investigación y desarrollo biofarmacéutico&D. El dominio de las variables y controles de la PCR es esencial para tener confianza predictiva y para la toma de decisiones ajustadas al riesgo en los procesos de descubrimiento y preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en Biofármacos R&D
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la amplificación rápida de dianas genéticas para pruebas de hipótesis y análisis de vías.
- Apoya la validación funcional de dianas al garantizar la detección específica y reproducible de ADN.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la manipulación controlada de variables y la resolución de problemas.
- Mejora la confianza predictiva al minimizar la amplificación no específica y los artefactos experimentales.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona plantillas de ADN validadas para el desarrollo de ensayos posteriores y flujos de trabajo de cribado.
- Normaliza las condiciones de reacción para garantizar la reproducibilidad y la obtención de resultados cuantitativos entre lotes.
- Posibilita la escalabilidad y el reutilización de plataformas mediante la optimización de los componentes de la reacción y los parámetros de ciclado.
- Facilita la evaluación confiable de compuestos al minimizar los falsos positivos derivados de productos no específicos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con estrategias traslacionales de biomarcadores al permitir la detección genética precisa en modelos preclínicos.
- Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante protocolos de amplificación robustos.
- Reduce el riesgo biológico mediante la resolución de problemas y la optimización de dianas genéticas relevantes para la enfermedad.
- Mejora la desviación predictiva al controlar la variabilidad y especificidad de la reacción.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
La PCR se sitúa en la intersección entre el descubrimiento temprano, el desarrollo de ensayos y la investigación preclínica, actuando como un facilitador esencial para el análisis genético y la validación de dianas.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la verificación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la amplificación específica de ADN.
- Selección: Proporciona plantillas de ADN listas para ensayos con resultados reproducibles y cuantitativos.
- Análisis: Ofrece lecturas claras para comparar condiciones experimentales y optimizar variables.
- Investigación Traducional: Conecta las fases de descubrimiento y preclínica al apoyar la alineación de biomarcadores y la validación genética.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad estandarizada y reutilizable para diversos objetivos genéticos y flujos de trabajo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los ensayos genéticos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los flujos de trabajo de amplificación de ADN.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al minimizar el riesgo de fallo experimental.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de objetivos genéticos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la preparación de reactivos, precisión en la pipetación y programación de cicladores térmicos.
- Necesita acceso a cicladores térmicos calibrados, sistemas de electroforesis en gel e infraestructura analítica.
- Exige estandarización entre equipos en el montaje de reacciones y en los protocolos de resolución de problemas.
- Debe adaptar las estrategias de optimización a diferentes moldes de ADN y conjuntos de cebadores.
- Las limitaciones prácticas incluyen la posibilidad de amplificación inespecífica y la necesidad de resolución de problemas iterativa.
