Multiplexado inmunoensayo fluorométrico Metodología de prueba y solución de problemas
12 de diciembre de 2011
Gracias a la tecnología Luminex Corporation microesfera xMAP, hemos desarrollado el inmunoanálisis fluorométrico multiplexada (MFIA) para la vigilancia serológica de las diversas especies de animales de laboratorio. El MFIA es un microarray de suspensión donde se covalentemente con el antígeno, tejido de control o inmunoglobulinas vinculado a microesferas de poliestireno con código de color. El método de prueba MFIA, así como diversos temas de solución de problemas se aborda.
El objetivo general del siguiente experimento consiste en detectar anticuerpos contra agentes infecciosos adventicios en animales de laboratorio. Esto se logra incubando el suero de prueba con microesferas recubiertas de antígeno. A continuación, el suero se incuba con una inmunoglobulina anti específica de especie marcada con biotina, que detecta cualquier complejo inmune antígeno-anticuerpo.
Luego se añade una solución de FICO eryn Fluor marcada con estreptavidina para detectar cualquier inmunoglobulina biotinilada. Los resultados obtenidos muestran un estado de anticuerpos positivo o negativo frente a agentes comunes en roedores de laboratorio, basado en fluorescencia múltiple, puntuación neta del inmunoensayo y valores de fluorescencia de la muestra. La principal ventaja de utilizar esta técnica frente al método existente como ELISA, es que MFIA es un ensayo multiplex. Esto permite a un investigador analizar hasta cien ensayos diferentes en una sola prueba.
Bueno, esta técnica disminuye la cantidad de muestras de suero y desechos desechables utilizados en los métodos existentes, a la vez que aumenta la cantidad de información generada a partir de una sola prueba. Bueno, tuvimos por primera vez la idea de usar este método cuando estábamos analizando un gran número de muestras de suero para múltiples agentes y deseábamos reducir la mano de obra y el tiempo de prueba. La procedimiento lo demostrará Donna Cohen, una tecnóloga sénior de nuestro laboratorio. Para comenzar, tenga listos dos tampones necesarios para el procedimiento de inmunoensayo fluorescente multiplex o MFIA.
El primero es un diluyente primario, disponible en Charles River, que contiene agentes bloqueadores patentados para reducir las interacciones inespecíficas en el tampón de lavado del ensayo. Prepare una solución de PBS con BSA al 1 %, pH 7,4, para eliminar partículas. Filtre el tampón a través de una unidad estéril de botella con filtro de 0,2 micrones hacia recipientes estériles etiquetados, utilizando el tampón de lavado del ensayo.
Prepare dos concentraciones x de especies antis biotiniladas, IGG o BAG, y strep AVID y FICO eritrocitina o SPE, que se utilizarán para marcar los complejos antígeno-anticuerpo formados durante el paso de incubación con suero de prueba, para preparar muestras de los siguientes materiales y desechables: micropipetas multicanal y de canal único con puntas, y placas microtituladoras de 96 pocillos de baja unión proteica para la dilución de proteínas. Después de recolectar las muestras de sangre y aislar el suero, vortexe brevemente el suero antes de diluir las muestras en diluyente primario en una placa microtituladora de 96 pocillos para asegurar una evacuación adecuada y uniforme de los pocillos. Precaliente cada pocillo de la placa de prueba de 96 pocillos con tampón de lavado del ensayo; aspire lentamente la solución durante todo el ensayo.
La aspiración debe llevar entre cinco y diez segundos para evitar la agregación de las perlas y su compactación en la membrana del filtro, ya que ambos fenómenos pueden ralentizar los tiempos de lectura al final del ensayo. Verifique que el drenaje del líquido haya cesado presionando suavemente la parte inferior de la placa de prueba con toallas de papel. Es importante presionar la placa de prueba tras cada paso de lavado para evitar la absorción capilar del líquido fuera de los pocillos durante la incubación.
Para preparar las perlas, comience por agitar la suspensión de perlas acopladas en stock mediante vortex. Luego, sóniquelas brevemente en un baño. Es fundamental resuspender adecuadamente las perlas para evitar la formación de agregados, lo que podría resultar en tiempos de lectura más largos.
A continuación, distribuya la suspensión concentrada 20 veces en una solución de perlas de trabajo 2 veces en el diluyente primario. Luego, distribuya 50 microlitros de la suspensión de perlas 2 veces en cada pocillo del ensayo de la placa de prueba previamente humedecida. Pipetee 50 microlitros de cada suero de prueba y control 2 veces hacia la placa de prueba según un mapa de placa predeterminado.
Cierre la tapa de la placa. Cúbrala con papel de aluminio e incube la placa de prueba durante 60 minutos en un agitador orbital a temperatura ambiente para evitar la evaporación de las soluciones, lo cual puede impedir el éxito del ensayo. Mantenga la placa de prueba cubierta con la tapa durante todos los pasos de incubación.
Además, la agitación debe ser superior a 400, pero inferior a 700 rpm para que las perlas permanezcan en suspensión y permitan a los anticuerpos del suero acceder a todas las superficies de los antígenos inmovilizados. Después de lavar la placa mediante incubaciones sucesivas de las perlas con BAG y SPE, lave nuevamente las muestras. A continuación, re suspenda las perlas añadiendo 125 microlitros de tampón de lavado del ensayo y agite durante dos minutos para leer la placa.
Colóquelo en el lector de ensayos dentro de los 10 minutos posteriores a la reconstitución de las perlas; las perlas pasan una a la vez a través de un detector donde son expuestas a dos láseres. Un láser excita los colorantes internos que identifican el conjunto de colores de las perlas y el otro excita el colorante marcador de FICO eritina. La intensidad de la fluorescencia de FICO eritina para un número predeterminado de perlas se informa como la lectura de FM FI. Lea el primer pocillo para verificar que el panel de perlas seleccionado coincida con el perfil de perlas en los pocillos de prueba.
Si hay perlas que caen fuera de su región designada en la visualización del protocolo, se ha realizado una selección incorrecta del perfil. Las perlas que se han resuspendido adecuadamente llenarán sus regiones especificadas tal como se indica en el software del lector de ensayos. Si las perlas están agregadas, llenarán sus regiones a una velocidad lenta.
Puede retirar la placa de prueba del lector y resuspender manualmente los pocillos para separar las perlas. Retire la placa de prueba del lector y, con un pipetador multicanal, aspire y expulse cada pocillo de tres a cuatro veces. Luego, devuelva la placa de prueba al lector y continúe examinando los resultados.
Informe de errores como recuentos inadecuados de microesferas o puntuaciones bajas de microesferas IgG anti IgG, y repita el ensayo para estas muestras. Después de exportar los datos a Excel y calcular la MFI neta, determine si alguno de los controles del ensayo de prueba excluye el suero inmune de rango alto. Cualquier control que falle es inaceptable y el ensayo debe repetirse.
Esta tabla representa los datos de suero de prueba y controles del ensayo procedentes de una placa de ensayo típica. Todos los controles de IgG pasaron. Los resultados de este ensayo indican que varias muestras de control de reactividad tisular y de IgG no pasaron, como se observa en los pocillos de color naranja.
A1C uno y F1 indican un fallo reactivo del tejido TC en el que la puntuación TC se representa entre paréntesis; los pozos B uno y E uno ilustran los dos tipos de fallos del control interno de IgG, anticuerpo de prueba insuficiente o reactivos de prueba insuficientes, BAG o SPE respectivamente. Los resultados de la placa de prueba se interpretan solo si el control de idoneidad del sistema y el control de suero cumplen con los criterios de aceptación mostrados aquí. Las microesferas recubiertas con inmunoglobulina anti-suero de prueba específica de especie pueden mostrar puntuaciones deficientes debido a la adición de una muestra insuficiente, una dilución de muestra demasiado alta, una especie incorrecta o al uso de suero de un huésped inmunodeficiente.
Si los resultados del control del ensayo de prueba son satisfactorios, las puntuaciones individuales del ensayo se clasifican de acuerdo con lo siguiente. Tras este procedimiento, debemos utilizar métodos adicionales como ELISA, IFA y/o blot de Western para confirmar hallazgos iniciales inesperados o positivos. Es fundamental verificar estos resultados antes de tomar cualquier decisión sobre el manejo de los animales.
Esto puede realizarse utilizando diferentes metodologías en la misma muestra o en muestras adicionales de la misma colonia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el inmunoensayo multiplex con fluorescencia y cómo interpretar los resultados obtenidos en su instalación. Esto le permitirá reducir la mano de obra mientras obtiene más información de cada pocillo de muestra en el ensayo.
Descripción general
Este estudio presenta el desarrollo del Ensayo Inmunométrico Fluorométrico Multiplex (MFIA) mediante la tecnología xMAP de Luminex Corporation para la serovigilancia en animales de laboratorio. El MFIA permite la detección simultánea de anticuerpos contra múltiples agentes infecciosos, mejorando la eficiencia y reduciendo el uso de recursos en las pruebas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Pruebas serológicas
- Salud de los animales de laboratorio
Antecedentes
- Los métodos serológicos tradicionales como ELISA son lentos y requieren muchos recursos.
- MFIA permite la multiplexación, lo que posibilita la realización simultánea de múltiples ensayos.
- Este método tiene como objetivo mejorar la detección de anticuerpos en animales de laboratorio.
- El uso eficiente de muestras de suero y material desechable es una ventaja clave de MFIA.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método más eficiente para detectar anticuerpos contra agentes infecciosos en animales de laboratorio.
- Reducir el trabajo y el tiempo de análisis asociados con los métodos tradicionales.
- Proporcionar una evaluación integral del estado de anticuerpos en una sola prueba.
Métodos Utilizados
- Incubación del suero de prueba con microesferas recubiertas con antígeno.
- Uso de inmunoglobulina biotinilada para detectar complejos antígeno-anticuerpo.
- Aplicación de soluciones de detección marcadas con estreptavidina para la medición de fluorescencia.
- Configuración de ensayo multiplex utilizando un formato de placa microtituladora de 96 pocillos.
Resultados principales
- Detección exitosa de anticuerpos contra diversos agentes infecciosos en animales de laboratorio.
- Reducción demostrada del volumen de suero y del uso de material desechable en comparación con los ensayos tradicionales.
- Obtención de resultados cuantitativos mediante análisis de fluorescencia multiplex.
- Identificación de posibles problemas con la agregación de microesferas que afectan el rendimiento del ensayo.
Conclusiones
- La AMIF es una alternativa viable a los métodos serológicos tradicionales.
- Esta técnica mejora la eficiencia de la serovigilancia en entornos de laboratorio.
- Puede ser necesaria una mayor optimización para abordar los desafíos técnicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El Ensayo InmunoFluorométrico Multiplexado (MFIA) satisface la necesidad de serovigilancia de alto rendimiento en la investigación preclínica al permitir la detección simultánea de anticuerpos contra múltiples agentes infecciosos. Esta capacidad reduce el consumo de muestras, el uso de reactivos y el tiempo del ensayo, a la vez que aumenta la densidad de datos por pocillo de prueba. Para la I+D de biofármacos, MFIA apoya la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar datos cuantitativos confiables sobre el estado inmunitario a partir de volúmenes limitados de muestras preclínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor Científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el análisis amplio del perfil de exposición a patógenos en modelos animales.
- Valor Operativo: Facilita la validación funcional de objetivos al aclarar variables de confusión derivadas de infecciones adventicias.
- Confianza Predictiva: Mejora la selección de proyectos al identificar modelos con integridad inmunológica comprometida.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante la verificación rigurosa del estado de salud.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante bolas de control interno (controles de tejido, IgG y adecuación del sistema).
- Escalabilidad: Permite la preparación para cribado de hasta 100 ensayos por pocillo, mejorando la reutilización de la plataforma en campañas de cribado de anticuerpos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Analiza la relevancia de la enfermedad al garantizar que los modelos animales estén libres de agentes infecciosos confusos que podrían alterar los resultados fenotípicos.
- Valor operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el mantenimiento de la integridad del modelo a lo largo de las fases del estudio.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Apoya los criterios de avance o no avance basados en el estado de salud serológico antes de la administración del compuesto.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
La AMIF se integra en el continuo de descubrimiento desde el descubrimiento temprano hasta la identificación de fármacos prometedores y el trabajo preclínico, sirviendo como una etapa de selección para la idoneidad del modelo antes del cribado de compuestos o las pruebas de eficacia.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método respalda la comprobación de hipótesis al verificar que los fenotipos observados no están provocados por infecciones subclínicas.
- Cribado: Describe la preparación del ensayo mediante salidas cuantitativas de MFI neta y controles integrados que garantizan la fiabilidad de los datos.
- Análisis: Destaca las mediciones de fluorescencia multiplex y los cálculos de puntuación neta que permiten la comparación entre condiciones de prueba y paneles de antígenos.
- Investigación Traslacional: Relaciona el método con la continuidad preclínica al asegurar que los sistemas relevantes para la enfermedad permanezcan inmunológicamente naïve o caracterizados adecuadamente.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable para el monitoreo continuo de la salud de colonias en múltiples proyectos y sitios.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista derivada de factores infecciosos de confusión.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad mediante detección multiplex basada en microesferas y controles internos.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del desarrollo, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas debido a exposición no detectada a patógenos.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en la salud verificada de los modelos animales.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados en los principios de inmunoensayos, tecnología Luminex e interpretación de datos multiplex.
- Requisitos de instrumentación e infraestructura analítica, incluyendo un lector Luminex, agitador de placas y sistema de detección de fluorescencia.
- Requisitos de estandarización entre equipos para la preparación de reactivos, manipulación de microesferas y consistencia en los protocolos de lavado.
- Consideraciones de adaptación en diferentes sistemas modelo, incluyendo la selección de antígenos específicos de especie y la validación de microesferas de control.
- Limitaciones prácticas respaldadas por la bibliografía: la agregación de microesferas que afecta los tiempos de lectura y la necesidad de una adecuada resuspensión para evitar falsos negativos o fondo elevado.
