La personalización de Aspergillus niger Morfología través de la adición de talco micro partículas

Este método genera y caracteriza estructuras morfológicas dependientes de micropartículas de hongos filamentosos, *Aspergillus niger*, para correlacionar la morfología fúngica con la productividad. Cultive *A. niger* con o sin micropartículas en un biorreactor agitado de tres litros durante 72 horas para calcular la productividad específica. Tome muestras en puntos de tiempo definidos y determine la biomasa, el peso seco y la actividad de la veto fructosasa.

Después de 72 horas, examine la morfología fúngica mediante microscopía y caractérela mediante análisis de imagen digital. Luego combine parámetros relevantes del análisis de imagen en un número de morfología que se correlaciona matemáticamente con la productividad específica. En última instancia, este método puede generar con precisión y caracterizar exhaustivamente la morfología de Aspergillus niger para una mejor comprensión de la morfogénesis de microorganismos filamentosos.

Aspergillus niger es un caballo de batalla industrial importante en biotecnología desde hace varias décadas. Una de las características más intrigantes y a menudo incontrolables de Aspergillus niger y especies relacionadas es su morfología compleja, que varía desde pellets esféricos densos hasta micelios viscosos, dependiendo de las condiciones de cultivo. La principal ventaja de nuestro procedimiento es que, mediante la adición de micropartículas, ahora podemos adaptar la morfología fúngica específicamente según las necesidades del proceso.

Hasta ahora, no se ha descrito ningún otro método para una personalización tan específica de la morfología fúngica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el cultivo de microorganismos filamentosos. Debido a que para la aplicación industrial, es fundamental controlar la morfología fúngica y también distinguir entre una morfología fúngica bien productora y otra poco productora.

Nuestro protocolo proporciona los medios para la personalización y caracterización deseables de la morfología fúngica. Aunque este método puede ofrecer información sobre la morfología de Aspergillus niger, también puede aplicarse a otros microorganismos filamentosos, como cepas de Penicillium o Strepto. Configure cuatro biorreactores para cultivos estériles según se detalla en el protocolo adjunto.

Texto basado en la adición de micropartículas, cultive Aspergillus niger con morfología diferente. Después de 72 horas, transfiera 50 mililitros. Muestras de caldo de cultivo a un tubo Falcon.

Las muestras de biomasa deben tomarse al menos por duplicado tras el secado en el desecador; pese un filtro de celulosa con las balanzas microanalíticas. Coloque el filtro en un embudo de Buchner con una bomba de vacío de chorro de agua conectada, filtre 10 mililitros de muestra seguidos de 10 mililitros de agua desionizada para eliminar los compuestos del medio de la biomasa. Doble el filtro una vez por la mitad.

Colóquelo en una placa de Petri de vidrio y en un secador de compartimentos hasta lograr constancia de peso. Transfiera el filtro a un desecador y déjelo enfriar. Luego mida el peso.

Calcule el peso seco de biomasa por litro mediante el cálculo del peso, la diferencia de los filtros y la posterior división por el volumen de la muestra para los ensayos de las enzimas glucosa oxidasa y peroxidasa. Almacene las muestras en hielo utilizando un paso con jeringa, 1,5 mililitros. Pase la suspensión de cultivo a través de un filtro de acetato de celulosa hacia un tubo de reacción para realizar el ensayo beta fructo SASE.

Con meticulosidad, garantizamos el éxito utilizando dos muestras por triplicado para lograr una solidez estadística. Para iniciar el ensayo, agregue 20 microlitros de muestra al tubo de ensayo; para controlar la escisión de sacarosa a glucosa dependiente del pH y la temperatura, utilice 20 microlitros de agua desionizada en lugar de 20 microlitros de muestra. Además, para cada muestra, prepare un control negativo para detectar la glucosa residual en el caldo de cultivo mediante el ensayo.

20 microlitros de muestra inactivada por calor. Para iniciar la reacción de sacarosa a glucosa, añada 200 microlitros de solución de sacarosa 1,65 molar. A pH 5,4, agregue 20 microlitros de muestra e incube todos los tubos de reacción en un bloque calefactor a 40 grados Celsius durante 20 minutos. Detenga la reacción calentando a 95 grados Celsius durante 10 minutos tras enfriar los tubos en hielo.

Centrifugar las muestras cuando sea necesario, diluir las muestras para el ensayo de modo que la absorción medida esté dentro del rango de valores calibrados. Ahora, para cada reacción, agregar dos microlitros de muestra en una placa de microtitulación. Realizar las mediciones de las muestras por triplicado.

Prepare también una curva patrón con 10 soluciones de glucosa que varíen desde un milimolar hasta 15 milimolares. Para la calibración del punto cero, utilice dos microlitros de agua desionizada. A continuación, agregue 200 microlitros de la solución del reactivo a cada una.

Incubar bien durante 10 minutos a temperatura ambiente. Medir la absorbancia a 450 nanómetros utilizando un lector de microplacas Sunrise de 96 pocillos y el software de recuperación de datos Magellan. Abrir la tabla de resultados con una hoja de cálculo y construir una línea de calibración de curva estándar.

Calcule la actividad para cada muestra. Luego, calcule la actividad de la beta-fructosidasa restando los valores del control negativo apropiado a la actividad de la muestra. Finalmente, calcule la productividad específica considerando el peso seco de la biomasa y la actividad de la beta-fructosidasa.

Coloque tres mililitros de suspensión de cultivo en una placa de Petri de plástico y diluya con solución fisiológica de cloruro de sodio para separar las estructuras morfológicas. La calidad de las imágenes microscópicas es de importancia excepcional. Para el análisis posterior de las imágenes, debe tenerse especial cuidado durante el paso de dilución.

Sitúe la placa de Petri bajo un microscopio equipado con una cámara integrada. Adquiera y guarde aproximadamente 100 imágenes de estructuras morfológicas por muestra, asegurándose de que al menos un objeto esté completamente representado en cada imagen. Continúe de la misma manera con las placas que contienen muestras de diferentes reactores, adquiriendo nuevas imágenes cada vez.

Observe la diferente forma de crecimiento morfológico de las muestras procedentes de distintos reactores cultivados con cantidades variables de polvo de talco añadido. A continuación, abra todas las imágenes de la misma muestra en el programa de procesamiento de imágenes Image J. Mediante la herramienta de proceso, convierta las imágenes a binario.

Convierta las imágenes a blanco y negro para aplicar el comando a una serie completa de imágenes. A continuación, utilice un código macro, abra una de las imágenes que contenga una barra de escala. Trace una línea recta a través de la barra de escala para determinar el número de píxeles que corresponden a 2000 micrones.

Seleccione la herramienta de análisis, configure la medición y elija los factores de forma, feret, área del diámetro y perímetro. Utilice un código macro para procesar una serie de imágenes. Ahora abra la hoja de cálculo que grafica los resultados de los valores del factor de forma.

Para cada imagen, calcule un número de morfología para cada imagen con todas las imágenes de una muestra. Calcule el valor medio del número de morfología. Utilice un programa de gráficos y análisis de datos para representar gráficamente el número de morfología frente a la productividad específica.

Determine la relación matemática mediante regresión matemática mediante la adición de concentraciones crecientes de micropartículas de talco. Ocho Niger SKAN 10 15. La morfología cambia de una morfología de gránulo verdadera a una morfología dispersa o incluso mi, ya que la morfología de gránulo esperada se exhibe en condiciones estándar.

Curiosamente, la morfología micelial se genera mediante la suplementación del medio con 10 gramos por litro de micropartículas de talco. Concurrentemente, la actividad de la beto fructo tasa aumenta aproximadamente tres veces; la suplementación con uno o tres gramos por litro de polvo de talco conduce a una morfología dispersa con una actividad de fructosa duplicada, utilizando parámetros determinados mediante análisis automático de imágenes. La morfología dependiente de micropartículas puede describirse exhaustivamente mediante morfología.

La nota del número, perfectamente redonda en gránulos lisos, aparecerá en imágenes microscópicas como círculos perfectos para tales partículas. El número de morfología tiene un valor que se aproxima a uno en condiciones estándar. La morfología en el reactor uno exhibe un número de morfología alrededor de 0,8.

La morfología en el reactor cuatro con 10 gramos por litro. El polvo de talco presenta un número de morfología alrededor de 0,1. El número de morfología para los reactores dos y tres con concentraciones de polvo de talco de uno y tres gramos por litro se encuentra entre estos extremos, demostrando una morfología dispersa.

Dado que la morfología dependiente de micropartículas está estrechamente relacionada con la productividad de las beta fructosas, existe una buena correlación matemática entre morfología, número y productividad tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biotecnología exploraran más a fondo la morfología fúngica y, en particular, su relación con la productividad. Tras este procedimiento de creación detallada de tipos cruzados morfológicos específicos de hongos, pueden explorarse otros aspectos importantes del cultivo de microorganismos filamentosos.

Se sabe, por ejemplo, que la morfología micelial es mucho más viscosa que la morfología de paleta. Por lo tanto, la productividad general del proceso se ve afectada por problemas y purificación del producto deseado. Nuestro número de morfología ayudará a establecer modelos relacionados con el cultivo, la pro teología, y profundizará nuestro entendimiento de la morfología fúngica en general.