Único ovocito Mutagénesis bisulfito

El objetivo general de este procedimiento es analizar la metilación del ADN en un ovocito individual. Esto se logra primero eliminando las células del cúmulo y el jabón palita de los ovocitos recolectados. El segundo paso consiste en incluir el ovocito en una solución de lisis de aros en proporción dos a uno para proteger la mínima cantidad de ADN de perderse o degradarse.

A continuación, se realiza la mutagénesis con bisulfito, seguida de la amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa anidada. El último paso consiste en ligar y clonar el producto de la PCR. Luego, se seleccionan los clones, se amplifican por PCR y se envían para secuenciación.

Finalmente, se utiliza la mutagénesis y secuenciación con bisulfito para demostrar la metilación del ADN en dinucleótidos citosina-fosfato-guanina, o CPG, de una región de interés en un único ovocito. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la mutagénesis con bisulfito en grandes números de células, es que se pueden obtener datos a partir de un solo ovocito sin necesidad de agrupar ovocitos, lo que evita sesgos en la PCR y contaminación de células quiméricas. El día de la recolección de ovocitos, prepare frescamente las soluciones indicadas en el protocolo escrito; al preparar las soluciones, reduzca la posibilidad de contaminación del ADN cambiando frecuentemente los guantes, utilizando puntas con filtro, manteniendo los tubos inclinados cuando estén abiertos y tapando todos los tubos cuando no estén en uso.

Comience la recopilación de OSI colocando los oviductos de ratón disecados en medio M2 y rompiendo el pulpoide M para extraer el complejo de células del cumulus. Luego, separe los citos del complejo de células del cumulus utilizando una solución de hialuronidasa a 0,3 miligramos por mililitro en una gota de 30 microlitros de medio M2. Mantenga los citos en solución solo durante el tiempo necesario para eliminar las células del cumulus, ya que una exposición prolongada podría dañarlos.

Lave los ovocitos en gotas de 30 microlitros de medio M dos transfiriendo los ovocitos de gota en gota. Elimine las células del cumulus periódicamente, para un total de tres lavados. Retire la Z de LUCITA utilizando solución Tyro ácida.

Primero coloque los ovocitos en una gota de 30 microlitros de solución, luego transfiera a otra gota de 30 microlitros. Esto se debe a que cualquier medio residual diluirá el ácido y reducirá su eficacia. Mantenga los ovocitos en la solución solo el tiempo necesario para eliminar la zona, ya que una exposición prolongada podría dañarlos.

Tras la eliminación de la zona, lave nuevamente los óocitos en una gota de 30 microlitros de medio M2 para realizar la inclusión en agarosa. En primer lugar, coloque la solución de lisis en un bloque térmico a 70 grados Celsius. Añada la agarosa de punto de fusión baja, o LMP Agarosa, precalentada a la solución de lisis, obteniendo una proporción de dos a uno de agarosa respecto a la solución de lisis. A continuación, coloque un solo óocito sobre un portaobjetos limpio con una cantidad mínima de medio M2.

El siguiente paso consiste en incrustar el único citoplasma en la solución de agarosa y lisis. Esto debe hacerse rápidamente, ya que la agarosa se endurecerá a temperaturas inferiores a 65 grados Celsius. Aspire 10 microlitros de la solución de agarosa y lisis en una punta de pipeta bajo un microscopio.

Expuje suavemente aproximadamente un microlitro o menos de la solución de lisis agros sobre el portaobjetos de vidrio, permitiendo que se mezcle con el medio mínimo. Aspire suavemente el ovocito dentro de la punta de la pipeta. Luego, coloque los 10 microlitros completos en un tubo einor con 300 microlitros de aceite mineral para que la gota resultante adopte una forma esférica.

Incube el tubo en hielo durante 10 minutos para realizar la lisis. Retire 300 microlitros de aceite mineral y agregue 500 microlitros del tampón de lisis SDS. Incube la muestra durante la noche en un baño de agua ajustado a 50 grados Celsius el segundo día.

Prepare las soluciones de mutagénesis con sulfuro de forma reciente según se describe en el protocolo escrito. Inicie la mutagénesis eliminando completamente los 500 microlitros de tampón de lisis SDS. Tenga en cuenta que cualquier tampón de lisis residual diluirá los agros cuando se calienten, y las perlas serán más susceptibles de disolverse en los pasos posteriores.

Tras la eliminación completa del tampón de lisis, añada 300 microlitros de aceite mineral. Incube la muestra durante dos minutos y medio en un bloque térmico a 90 grados Celsius. Tenga cuidado de no mezclar, agitar, extender ni fluctuar la temperatura.

Después de dos minutos y medio, incubar la muestra en hielo durante 10 minutos. Para realizar la desnaturalización, retirar el aceite mineral y añadir un mililitro de hidróxido de sodio 0,1 molar al tubo; agitar mediante movimientos rápidos y girar el tubo de cinco a seis veces.

Incube la muestra durante 15 minutos. En un baño de agua ajustado a 37 grados Celsius, invierta cada tres a cuatro minutos; la perla debe flotar en el hidróxido de sodio. Observe que la perla ya no está en el fondo del tubo.

Para realizar el tratamiento con sulfito, gire suavemente el tubo tras retirar el hidróxido de sodio. Añada 300 microlitros de aceite mineral y 500 microlitros de solución de sulfito BIS. Tenga cuidado de evitar la exposición a la luz e incube el tubo durante tres horas y media en un baño de agua a 50 grados Celsius.

Ahora realice la desulfonación. Incube primero la muestra en hielo durante tres minutos antes de eliminar el aceite mineral y la solución de bisulfito BIS. Después de una centrifugación suave, agregue un mililitro de hidróxido de sodio 0,3 molar, agite y invierta el tubo de cinco a seis veces.

Incube la muestra durante 15 minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius, invirtiendo cada tres o cuatro minutos. Una vez más, la perla debe flotar en el hidróxido de sodio antes de comenzar la PCR. Lave las muestras girándolas suavemente primero.

Luego, retire el hidróxido de sodio y agregue un mililitro de XTE 1x pH 7,5. Agite durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. Tras una segunda centrifugación suave, retire el XTE 1x.

Repita este proceso de lavado dos veces. A continuación, agregue un mililitro de agua destilada doblemente estéril. Agite durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente, centrifugue suavemente por tercera vez y retire el agua.

Repita el lavado con agua doblemente destilada dos veces. Finalmente, elimine todo el sobrenadante, dejando solo la perla de aros. Verifique que el pH del sobrenadante sea 5,0.

Si el sobrenadante aún es demasiado básico, lave nuevamente las perlas con agua doblemente destilada. Mientras tanto, agregue la mezcla de PCR de la primera ronda al tubo de PCR según se describe en el protocolo escrito. Deslice el agro speed sólido hasta el borde del tubo einor.

Luego, transfiera cuidadosamente el agro speed al tubo de PCR y caliente a 70 grados Celsius durante un minuto y mezcle; luego se sugiere la amplificación según el protocolo escrito. Tras la amplificación de la primera ronda, prepare la reacción de PCR de segunda ronda utilizando cinco microlitros del producto de la primera ronda como molde. Asegúrese de pipetear por debajo de la capa de aceite mineral.

Proceda a realizar la segunda ronda de amplificación según se indica en el texto como una prueba diagnóstica. Las muestras de la segunda ronda pueden digerirse con una enzima de restricción específica de metilación o cepa, y los productos de digestión se separan mediante electroforesis en un gel de acrilamida al 8%. Cualquier banda heterogénea resultante representa más de una secuencia; para clonar el producto de la segunda ronda, ligúelo al vector y realice el clonado TA según se describe en el manuscrito que acompaña a este video. Tras el clonado TA, plaque toda la mezcla de reacción en una placa de agar con LB, suplementada con ampicilina, X-gal e IPTG, e incube la placa a 37 grados Celsius durante la noche.

Luego agregue la mezcla maestra de PCR de colonias al tubo de PCR según se indica en el protocolo escrito. Seleccione una colonia bacteriana blanca de la placa con la punta de una pipeta y revuélvala en 35 microlitros de la mezcla maestra de PCR de colonias en un tubo de PCR. Proceda a amplificar la suspensión según se describe en el texto siguiente: realice electroforesis de cuatro microlitros del producto de PCR en un gel de AGAROSA al 1,5 %.

Finalmente, envíe aproximadamente 30 microlitros del producto de PCR para secuenciación de cinco PCR de colonias por célula. Una vez obtenidos los resultados de secuenciación, se pueden leer los patrones de metilación: cualquier citosina guanina original que se mantuvo como tal estaba metilada. Por el contrario, cualquier citosina guanina original que ahora es una timina guanina no estaba metilada tras la amplificación por PCR anidada utilizando cebadores convertidos con bisulfito.

Es posible confirmar una conversión exitosa mediante la visualización de un tamaño de fragmento correcto en un gel de agarosa con metáfasis individual. Dos ovocitos representan un alelo parental y, en teoría, tienen un patrón de metilación impreso. Como tal, los productos de la segunda ronda de PCR pueden ser analizados para detectar contaminación involuntaria.

Puede utilizarse una enzima de restricción sensible a la metilación del ADN para digerir el producto de la PCR de segunda ronda y evaluar si contiene un alelo metilado o no metilado. Aquí, una citosina metilada dentro de la secuencia de reconocimiento de la enzima es cortada. Mientras que una citosina no metilada que se convierte en timina ya no es reconocida por la enzima y permanece intacta, cualquier muestra de ovocito en metafase II que contenga ambos alelos, metilado y no metilado, debe descartarse, ya que indica contaminación con células del cumulus o inclusión del cuerpo polar tras la ligación y transformación.

La amplificación exitosa de la PCR de colonia se puede visualizar en un gel AROS para asegurar que las muestras con el tamaño correcto del producto se envíen para secuenciación. En este ejemplo, el tamaño esperado del amplicón tras la ligación es de ciento cincuenta y seis pares de bases. Aquí, el clon cinco tiene un tamaño de amplicón incorrecto y no debe enviarse para secuenciación.

La secuencia de cinco clones individuales de un ovocito en metafase II debe producir cinco patrones de metilación idénticos y tasas idénticas de conversión no CPG. Cualquier muestra que contenga más de un patrón debe descartarse. Dado que los ovocitos en metafase II ovulados tienen dos copias cromosómicas o un cuerpo polar adherido, existe la posibilidad de obtener dos patrones de secuencia similares.

Los datos deben descartarse de cualquier citocito que presente patrones de metilación altamente disímiles. Dado que no puede descartarse la contaminación por células del cumulus, al intentar este procedimiento, es importante recordar primero lavar múltiples veces los ovocitos en medio fresco, tras el tratamiento con HI IDE, para eliminar tantas células del cumulus como sea posible. En segundo lugar, el agarosa de punto de fusión bajo se endurece a temperaturas inferiores a 65 grados Celsius, por lo que se debe trabajar con cuidado pero con rapidez.

Y finalmente, el bisulfato de sodio y la hidroquinona son sensibles a la luz, por lo que los tubos de reacción y las soluciones deben envolverse con papel de aluminio.