La evaluación de la replicación y la función celular beta en Adenovirally transducidas aislados islotes de roedores
25 de junio de 2012
Este protocolo permite a uno identificar los factores que modulan la masa funcional de las células beta para encontrar posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de la diabetes. El protocolo consiste en un método simplificado para evaluar la replicación de islotes y la función de las células beta en los islotes de rata aislados siguientes manipulación de la expresión génica con adenovirus.
El objetivo general de este procedimiento es identificar las vías de señalización que regulan los cambios en la masa funcional de células beta. Esto se logra en islotes pancreáticos aislados de rata mediante la sobreexpresión o supresión de la expresión de un gen utilizando vectores adenovirales. Tras esta manipulación, la función de las células beta se evalúa mediante la secreción de insulina y la replicación de los islotes se mide por la incorporación de timidina tritiada.
En última instancia, estos ensayos pueden mostrar si un gen de interés regula la proliferación y/o función de las células beta in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del párpado, como por ejemplo si un componente particular de una vía de señalización influye en el crecimiento y la función de las células beta. Prepare una placa de seis pocillos no recubierta para cultivo de tejidos añadiendo dos mililitros de medio modificado al número requerido de pocillos.
Por ejemplo, un experimento típico puede requerir tres pocillos, uno para un control sin virus, uno para un control con virus y otro para el grupo experimental; caliente la placa a 37 grados Celsius en un incubador de cultivo de tejidos durante al menos 30 minutos. Inmediatamente después del aislamiento de los ocelos de rata, coloque de uno a 200 ocelos en cada pocillo de la placa preparada. Se utilizarán 60 ocelos para ensayos bioquímicos y los ocelos restantes pueden emplearse para estudios de expresión génica o inmunotransferencia; agite suavemente la placa para centrar los ocelos en cada pocillo.
A continuación, pipetee inmediatamente el adenovirus directamente sobre los orificios, en el centro del recipiente. Utilice una multiplicidad de infección de 1 a 500, dependiendo de la eficacia del adenovirus para sobreexpresar o reducir la expresión de su proteína de interés.
Una penetración adenoviral eficiente hasta el núcleo del párpado aumenta la consistencia de los resultados. Es esencial transducir los párpados inmediatamente después del aislamiento del párpado.
No perturbe la placa durante cinco minutos, luego colóquela en el incubador durante 24 horas. Al día siguiente, retire la placa del incubador e hinche suavemente los orificios hacia los centros de los pocillos. Transfiera los orificios a un nuevo pocillo que contenga medio fresco utilizando una micropipeta de 200 microlitros.
Si los orificios se adhieren a la placa, pueden desacoplarse suavemente con la punta de la pipeta. Es útil utilizar un virus de control que exprese GFP para verificar una eficiencia adecuada de transducción mediante microscopía confocal, visualizando la penetración del adenovirus en el cultivo del núcleo de los islotes. Los islotes se mantienen durante uno a tres días más, cambiando el medio diariamente.
El tiempo de cultivo debe optimizarse mediante estudios piloto y varía según los objetivos experimentales. Durante las últimas 24 horas, incorpore timidina tritiada al medio en una concentración de un microcurio por mililitro de medio. Primero, prepare frescamente 50 mililitros del SAB de trabajo en un tubo cónico de 50 mililitros y caliéntelo en un baño de agua a 37 grados Celsius.
Pipetee 10 mililitros de SAB de trabajo en un tubo cónico de 15 mililitros y añada 66,8 microlitros de D-glucosa 2,5 molar. Para preparar el SAB con alta concentración de glucosa, añada 44,8 microlitros de D-glucosa 2,5 molar a los 40 mililitros restantes de SAB de trabajo. Para preparar el SAB con baja concentración de glucosa, etiquete a continuación tres tubos microc&entrf;trifugos de 1,7 mililitro.
Para cada pocillo de la placa de seis pocillos, agregue un mililitro de PBS a cada tubo. No olvide seguir los protocolos institucionales para el manejo y la eliminación de los anillos radiactivos. Utilizando un estereoscopio o un microscopio estándar, seleccione y transfiera 20 anillos de tamaño comparable a cada tubo de microcentrífuga.
Por ejemplo, cada tubo puede contener cinco ojales pequeños, diez medianos y cinco grandes. Aunque los resultados se normalizan respecto al contenido total de proteína al final del experimento, es fundamental que los ojales estén emparejados por tamaño entre los grupos. Después de permitir que los ojales se sedimenten en el fondo del tubo por gravedad o mediante centrifugación, aspire, pese la PBS con una micropipeta y luego continúe con la preparación de los ojales para los ensayos bioquímicos.
Para preparar los ojales para el ensayo de secreción de insulina, primero deben preincubarse con SAB de baja glucosa. Para ello, añada 400 microlitros de SAB de baja glucosa a los tubos y colóquelos con sus tapas en el incubador de cultivo de tejidos durante 60 minutos. Pasada una hora, aspire el SAB de baja glucosa de preincubación para medir la secreción basal de insulina. Repita el procedimiento de preincubación.
Sin embargo, para medir la secreción estimulada de insulina, utilice 400 microlitros de SAB con alta concentración de glucosa en lugar de SAB con baja concentración de glucosa y, como antes, incube los anillos durante 60 minutos. Después de la incubación en SAB con alta o baja concentración de glucosa, aspire el SAB para el radioinmunoensayo de insulina, el cual se realizará según el protocolo del fabricante. A continuación, continúe con el ensayo de incorporación de timidina utilizando la misma colección de anillos. Comience con los anillos recién utilizados para el ensayo de secreción de insulina.
Añada un mililitro de PBS y deje que los orificios se sedimenten por gravedad. Luego aspire el PBS con una pipeta micrométrica. Deseche y repita este paso una vez más.
A continuación, agregue 500 microlitros de ácido tricloroacético frío a los orificios y colóquelos a hielo durante 30 minutos. Centrifugue los tubos a cuatro grados Celsius. Luego aspire y deseche el TCA.
A continuación, agregue 80 microlitros de hidróxido de sodio 0,3 normal y incube los ojales durante 30 minutos a temperatura ambiente. Durante esta incubación, vortexe vigorosamente las muestras durante cinco a 10 segundos cada 10 minutos. En paralelo, agregue cuatro mililitros de un cóctel de conteo conno safe a tubos de centelleo líquido de siete mililitros.
Una vez finalizada la incubación de los orificios, añada 50 microlitros de los orificios a un tubo de centelleo. Agite brevemente el tubo tapado y mida la radioactividad de las muestras en un contador de centelleo líquido. Para medir también la concentración de proteína, transfiera 10 microlitros de vilas a un ensayo comercial de ácido biónico y siga el protocolo del fabricante.
Posteriormente, durante el análisis de datos, normalice los resultados a la concentración de proteína utilizando los protocolos descritos. Replicación de islotes y función de las células beta. En islotes de rata, una sobreexpresión adenoviral del gen hipotético seis estimuló robustamente la replicación de islotes sin alterar la función de las células beta.
Expresión aumentada del gen seis, síntesis de ADN incrementada medida mediante la incorporación de timidina, ya que la mayoría de las células en el ojal del ratón son células beta. Experimentos adicionales podrían demostrar que este aumento en la incorporación de timidina se debe a un incremento en la replicación de células beta. El ensayo de secreción de insulina mostró que la sobreexpresión del gen seis no alteró una de las funciones principales de la célula beta: la secreción de insulina en condiciones de glucosa baja y alta.
El aumento en la secreción de insulina a concentraciones bajas y altas de glucosa refleja la salud de los islotes después del tratamiento con adenovirus. Si el aumento en la expresión del gen seis afectara la función de las células beta, esto probablemente se manifestaría como una disminución en la insulina secretada a concentraciones altas de glucosa estimulante. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la replicación de las células beta y la secreción de insulina para determinar si un gen determinado influye en el crecimiento o la función de las células beta.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este protocolo permite la identificación de vías de señalización que regulan la masa funcional de células beta, lo cual es crucial para el tratamiento de la diabetes. El método evalúa la replicación de islotes y la función de las células beta en islotes de rata aislados mediante la manipulación de la expresión génica utilizando vectores adenovirales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Endocrinología
- Biología celular
Antecedentes
- Comprender la masa de células beta es fundamental para la investigación sobre la diabetes.
- Los islotes aislados de rata sirven como modelo para estudiar la función de las células beta.
- La expresión génica puede manipularse para estudiar sus efectos sobre las células beta.
- La secreción de insulina y la replicación de los islotes son indicadores clave de la salud de las células beta.
Objetivo del estudio
- Identificar factores que modulan la masa de células beta funcionales.
- Encontrar posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de la diabetes.
- Evaluar el impacto de genes específicos en la proliferación y función de las células beta.
Métodos Utilizados
- Manipulación de la expresión génica mediante vectores adenovirales.
- Evaluación de la función de las células beta mediante la medición de la secreción de insulina.
- Evaluación de la replicación de islotes mediante la incorporación de timidina tritiada.
- Uso de una placa de seis pocillos sin recubrimiento para cultivo de tejidos en los experimentos.
Resultados principales
- Identificación de genes específicos que influyen en el crecimiento de las células beta.
- Demostración de la relación entre la expresión génica y la función de las células beta.
- Conocimientos sobre las vías de señalización que afectan la masa de las células beta.
- Identificación de posibles dianas terapéuticas para la diabetes.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un enfoque simplificado para estudiar la biología de las células beta.
- La manipulación de la expresión génica puede revelar información importante sobre la diabetes.
- Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la endocrinología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La manipulación de la expresión génica en islotes aislados de roedores mediante vectores adenovirales permite la evaluación sistemática de las vías que regulan la replicación y función de las células beta, un punto crítico para el descubrimiento de terapias contra la diabetes. Este enfoque proporciona confianza predictiva en la validación de dianas al distinguir los efectos sobre la proliferación celular de los impactos en la secreción de insulina. El método apoya decisiones de cartera ajustadas al riesgo al aclarar si las dianas candidatas aumentan la masa de células beta sin comprometer su función.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar la función de genes candidatos en el crecimiento de células beta y en la secreción de insulina.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al aislar los efectos sobre la replicación frente a la función.
- Facilita la identificación de dianas que aumentan la masa funcional de células beta para la investigación de la diabetes.
- Proporciona un sistema controlado para la aclaración de vías y la comprobación de hipótesis.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Establece modelos validados de islotes para la evaluación cuantitativa de los resultados de la manipulación génica.
- Proporciona lecturas reproducibles de secreción de insulina y replicación para cribados posteriores.
- Facilita la estandarización de ensayos mediante la normalización al contenido proteico y a islotes emparejados por tamaño.
- Permite la evaluación confiable de dianas génicas para cribados posteriores de compuestos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea hallazgos in vitro con mecanismos relevantes para la enfermedad en la diabetes.
- Proporciona continuidad desde la validación inicial de genes hasta la priorización preclínica de dianas.
- Apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales al vincular los efectos génicos con resultados funcionales.
- Reduce el riesgo biológico en fases tardías al aclarar el impacto de la diana tanto en la proliferación como en la función.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica al permitir la validación temprana de dianas, la reducción de riesgos mecanicistas y el desarrollo de ensayos para la investigación de la diabetes.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba basada en hipótesis de la función génica en la replicación de células beta y la secreción de insulina.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para la preparación del ensayo y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece mediciones normalizadas de la síntesis de ADN y la secreción de insulina para comparaciones estadísticas sólidas.
- Investigación Traducional: Conecta la validación génica in vitro con puntos finales funcionales relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para la evaluación sistemática de múltiples objetivos génicos en la biología de los islotes.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación del blanco y reduce la ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Estandariza la manipulación génica y la evaluación funcional en islotes aislados.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción y mejora la eficiencia del capital al aclarar tempranamente los efectos del blanco.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos para las líneas terapéuticas contra la diabetes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en aislamiento de islotes, transducción con adenovirus y ensayos funcionales.
- Exige acceso a infraestructura de cultivo celular, microscopía confocal y conteo por centelleo líquido.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos de los protocolos de ensayo y las estrategias de normalización.
- La adaptación a otros sistemas modelo puede requerir la optimización de la administración viral y las condiciones del ensayo.
- Las etapas de marcado radiactivo y cuantificación de proteínas requieren cumplir con los protocolos de seguridad institucionales.
