Un alto contenido

El objetivo general de esta plataforma de cribado de alta densidad para la replicación de células beta es facilitar la investigación de las vías moleculares que restringen el crecimiento de las células beta. Este método puede ayudar a responder preguntas importantes en el campo de la biología de las células beta, como por ejemplo cuáles son las moléculas y vías de señalización clave que controlan la regeneración de las células beta.

Las principales ventajas de esta técnica son que permiten aumentar el rendimiento del revestimiento celular para una evaluación específica y el análisis automatizado de datos de la replicación de células de islotes primarias. La aplicación de esta técnica tiene el potencial de contribuir al desarrollo de terapias regenerativas para la diabetes, una enfermedad con un alto costo sanitario y económico para nuestra sociedad.

Comience utilizando una jeringa de 10 mililitros cargada con una solución digestiva pancreática y equipada con una aguja de calibre 22 para canular el conducto biliar común en la unión del conducto cístico y el conducto hepático común o ligeramente distal a esta. Sosteniendo el conducto biliar común con el mango de un escalpelo, inyecte lentamente 10 mililitros de la solución. Una vez administrada toda la colagenasa, utilice fórceps curvo y tijeras para separar el páncreas inflado del colon descendente, los intestinos, el estómago y el bazo.

Luego, coloque hasta dos páncreas en un tubo de 50 mililitros sobre hielo que contenga cinco mililitros de solución de digestión pancreática. Cuando se hayan recolectado todos los páncreas, coloque los tubos de digestión en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 15 minutos, agitando suavemente cada tres minutos. Al finalizar la digestión, agite vigorosamente los tubos verticalmente 10 veces.

Añada 10 mililitros de tampón de lavado frío a las muestras. Agite vigorosamente los tubos cinco veces más y colóquelos sobre hielo. A continuación, complete los tubos hasta un volumen final de 50 mililitros con tampón de lavado frío e invierta los tubos cinco veces.

Luego, centrifugue los tejidos y deseche los sobrenadantes, teniendo cuidado de no desalojar los pellets. Re-suspenda la suspensión de tejido en 25 mililitros de tampón de lavado seguido de una vortexación suave. Repita los pasos de centrifugación y re-suspensión otras dos veces.

Vierta las suspensiones de tejido a través de un tamiz de tejido de 30 mallas en un vaso de precipitados estéril de 250 mililitros. Enjuague los tubos de digestión con 20 mililitros adicionales de tampón de lavado y vierta los lavados sobre el tamiz para eliminar los tejidos pancreáticos y adiposos no digeridos. Divida el material filtrado entre dos nuevos tubos de 50 mililitros y haga un pellet del tejido mediante centrifugación.

Luego, decante el sobrenadante e invierta los tubos para drenar el exceso de tampón. Para purificar los islotes, agregue 20 mililitros de gradiente de densidad frío a los pellet de tejido pancreático y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo cinco veces para resuspender homogéneamente el contenido. A continuación, superponga lentamente 10 mililitros de HBSS por la pared de cada tubo del gradiente, teniendo cuidado de mantener una interfase líquida nítida y separe las células pancreáticas mediante centrifugación.

Utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir la capa de islotes desde la interfase hacia nuevos tubos cónicos de 50 mililitros. Luego, lave los islotes tres veces con 40 a 50 mililitros de tampón de lavado. Invierta los tubos para re-suspender los precipitados entre cada centrifugación.

Después del último lavado, lleve los tubos a una cabina de cultivo celular. Aspire el sobrenadante y re-suspenda los sedimentos en seis mililitros de medio para islotes.

Cribe los islotes de cada tubo en pozos individuales de una placa de cultivo celular de seis pozos. Agita suavemente la placa para reunir los islotes en el centro de los pozos. Evalúa la pureza de los islotes bajo el microscopio.

Para purificar aún más los islotes, recójalos utilizando una pipeta de un mililitro y transfiéralos al pocillo adyacente usando seis mililitros de medio para islotes. Repita el remolino, la recogida, la transferencia de islotes y la evaluación microscópica hasta alcanzar una pureza superior al 90 por ciento. A continuación, transfiera los islotes a un solo plato de cultivo de tejidos de 10 centímetros que contenga 20 mililitros de medio para islotes.

Después de cosechar todos los islotes, coloque la placa de cultivo en un incubador de cultivo de tejidos durante la noche. Luego, recubra los pocillos de una placa de 384 pocillos con 40 microlitros de medio condicionado 804G por pocillo y coloque la placa en el incubador durante la noche. Al día siguiente, use un raspador celular para desprender suavemente los islotes.

Luego, transfiera los islotes a un tubo de 50 mililitros. Recopile los islotes mediante centrifugación. A continuación, lávelos con 20 mililitros de PBS tibio.

Centrifugar durante un minuto. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en tripsina al 0,25 por ciento.

Incube los islotes durante 10 minutos a 37 grados Celsius utilizando una pipeta de un mililitro para aspirar y dispensar los islotes 10 veces a los cinco y 10 minutos. Después de la segunda trituración, cuente una muestra de 20 microlitros de las células de islotes tratadas con tripsina. Si los tejidos están completamente digeridos, suspenda las células de islotes disociadas a una concentración de cuatro coma cinco por diez a la cuatro células por mililitro en medio para función de islotes.

Luego, utilice un aspirador de bloque de 12 pocillos para eliminar el medio condicionado de 804G de la placa de 384 pocillos previamente preparada. Y tamice 70 microlitros de islotes por pocillo en las filas c a n y columnas cuatro a 21. Deje que los islotes se adhieran en el incubador de cultivo celular durante 48 horas.

Después de dos días, utilice el aspirador de placa de 12 pocillos para eliminar cuidadosamente el medio de islotes y use una pipeta de 12 canales para añadir 35 microlitros de medio de función de islotes a cada pocillo. Luego transfiera 35 microlitros de las soluciones recién preparadas al doble de concentración de los compuestos de interés a cada pocillo. A continuación, devuelva los islotes al incubador durante otras 48 horas.

Después de 48 horas, fije, tiña y analice los cultivos de islotes tratados con el compuesto utilizando una plataforma automatizada de imágenes de alto contenido. En un experimento típico, la tasa de replicación de las células beta positivas para DAPI, PD-1 e insulina se determina por el porcentaje de células beta que expresan simultáneamente Ki-67. La replicación de las células alfa se mide como el porcentaje de células positivas para DAPI, negativas para PD, positivas para glucagón y que expresan simultáneamente Ki-67.

Por ejemplo, en este experimento representativo, se observó que la dipiridamol promueve la replicación de células beta pero no de células alfa. Esta técnica puede completarse en siete días. Tras este procedimiento, los compuestos que afectan la replicación de células beta pueden estudiarse más a fondo para revelar sus mecanismos de acción.

Esta técnica ha permitido a las investigaciones en el campo de la biología de las células beta identificar nuevos factores y vías de señalización que regulan el crecimiento de las células beta. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la capacidad de pequeñas moléculas para estimular selectivamente la regeneración de las células beta.