Microdiálisis de etanol durante etanol operante determinación y la auto-administración de etanol por cromatografía de gases

El objetivo general de este procedimiento es monitorear los niveles de etanol en el dializado cerebral durante una sesión de autominición de etanol. Con el fin de comparar esta medida con los comportamientos sincrónicos de autominición, esto se logra primero mediante la implantación quirúrgica de una guía de microdiálisis, una cánula y un perno de sujeción, y luego entrenando a las ratas para que administren operativamente etanol. El segundo paso consiste en habituar a las ratas al arnés de sujeción craneal para que este no interfiera con la autominición de etanol durante la microdiálisis.

Luego se realiza una microdiálisis durante una sesión de autominicistración de etanol, en la cual se prepara una porción del dializado para el análisis de etanol. A continuación, las muestras de dializado se analizan para determinar la concentración de etanol mediante un cromatógrafo de gases con detección por ionización de llama. Finalmente, los resultados obtenidos muestran el curso temporal del etanol al alcanzar la región cerebral de interés durante una sesión de autominicistración de etanol.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la punción de la cola o de la vena safena es que este procedimiento es mínimamente invasivo en el momento de la recolección de la muestra y permite la medición de fármacos a lo largo del tiempo en la región cerebral de interés mientras el animal realiza una tarea conductual. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque requiere varias habilidades especializadas, muchas de las cuales solo pueden adquirirse mediante práctica repetida o experiencia. Asimismo, el procedimiento será demostrado por Jeffrey Dilley, un asistente de investigación de pregrado en nuestro laboratorio.

Todos los procedimientos con animales mostrados han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas y siguen todas las guías para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Para estos experimentos de microdiálisis conductual se utilizan ratas Long Evans bien manipuladas, alojadas en una instalación acreditada por ALAC, la Universidad de Texas en Austin, que han sido implantadas quirúrgicamente con una cánula de 21 gauge por encima de la región cerebral de interés. Todos los animales deben recibir al menos una semana de cuidados y recuperación postquirúrgica, y deben encontrarse sanos antes de comenzar los siguientes procedimientos.

Coloque la rata en una cámara operante de Med Associates, equipada con una palanca retráctil Lichter y un tubo dosificador, y entrénela para que presione la palanca a fin de obtener acceso a una solución de sacarosa al 10 %. Una vez que la rata esté entrenada para responder por la solución de sacarosa, comience con un programa de entrenamiento adecuado durante el cual se agregue etanol gradualmente a la solución en varias sesiones de consumo la noche anterior a la penúltima sesión operante. Después de anestesiar al animal y verificar el nivel de sedación, sujete el muelle del arnés al perno del arnés en la plataforma craneal de la rata para habituarla al aparato, que consiste en una palanca de contrapeso, un brazo, un arnés giratorio, un muelle y un soporte con anillos.

Deje que la rata pase la noche en la sala de condicionamiento operante dentro de su jaula con acceso ad libitum a alimento y agua, y luego realice la sesión de entrenamiento del día siguiente con el cable y el equipo correspondiente colocados el día anterior al experimento de microdiálisis. Después de anestesiar a la rata con isoflurano, verifique la sedación realizando una compresión del dedo del pie e inserte una sonda de microdiálisis perfundida con líquido cefalorraquídeo artificial. Fije adecuadamente la sonda y luego ajuste la velocidad de flujo de la sonda a 0,2 microlitros por minuto.

Coloque la rata en su jaula de alojamiento en la sala de condicionamiento operante para pasar la noche con todo el equipo de diálisis colocado, y suministre alimento y agua ad libitum. Al día siguiente de la inserción de la sonda, al menos dos horas antes de que comience el experimento, aumente el flujo de la sonda hasta su velocidad de trabajo. Utilizando una jeringa Hamilton, verifique que el caudal de la sonda sea constante y que sea al menos el 90 % del caudal establecido.

Si se evalúan neurotransmisores en las muestras de diálisis, tome muestras durante todas las fases del experimento. Comience recolectando muestras de diálisis mientras el animal está en su jaula de origen. Almacene las muestras de manera adecuada para su análisis posterior.

Transfiera cuidadosamente la rata a la cámara operante e inicie el programa operante que controla la cámara. Continúe tomando muestras mientras la rata espera a que la palanca se extienda dentro de la cámara, dos muestras antes de que la palanca se extienda. Comience a recolectar una porción de cada muestra de dializado para el análisis de etanol pipeteando una alícuota adecuada de dializado en un vial de vidrio de dos mililitros y sellando el vial con una septa hermética, pipeteando y sellando rápidamente las muestras de etanol.

Dado que el etanol es volátil y el volumen de la muestra es pequeño, una preparación de muestras inconsistente o lenta dará lugar a resultados inexactos. Almacene el resto para el análisis de neurotransmisores. El período de bebida de 20 minutos comienza después de que el programa informático de Med Associates extienda la palanca en la cámara y la rata la presione para acceder a una botella de solución bebible.

Continúe tomando muestras durante todo el período de bebida. Después del período de bebida, el programa informático retrae la botella de la cámara. Mantenga al animal en la cámara durante un período adicional de 20 minutos tras la ingesta, al final del experimento de microdiálisis. Tras anestesiar la rata, retire la sonda.

Si el animal no se sacrifica de inmediato de forma humanitaria, reemplace el obturador para asegurar la visualización del trayecto de la sonda. Recolecte el cerebro dentro de los tres días posteriores al experimento. Analice las muestras junto con patrones externos de etanol utilizando un cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama, un muestreador automático de espacio de cabeza calentado a 50 grados Celsius y una columna capilar con helio como fase móvil.

Para registrar y analizar los cromatogramas, utilice un software de estación de trabajo de cromatografía para preparar el sistema para el análisis de etanol. Utilice un baño de agua con recirculación para calentar la placa del muestreador automático y abra los tanques de aire e hidrógeno. A continuación, inicie el programa de arranque.

Cuando esté listo, inicie una combustión de 20 minutos, que descontamina la fibra. Elabore estándares utilizando un matraz aforado de 100 mililitros para diluir 238 microlitros de etanol al 95 % con agua hasta un volumen final de 100 mililitros. Utilice una dilución seriada uno a uno para crear los estándares.

Pipetee los patrones en viales de vidrio y séllelos exactamente como se prepararon las muestras. Asegúrese de incluir un blanco de agua junto con sus patrones. Coloque los patrones y las muestras en la bandeja del muestreador automático y caliéntelos hasta que toda la alícuota líquida se haya vaporizado.

Para ejecutar los estándares y las muestras, cree una lista de muestras indicando qué muestra se encuentra en cada ranura del muestreador automático y especifique que cada muestra debe ser perforada. Una vez que las rutas de los archivos de datos se hayan dirigido a una carpeta seleccionada, elija un método adecuado para las muestras e inicie la corrida. Después de que el sistema haya procesado las muestras, verifique que el programa haya integrado correctamente cada pico.

Represente gráficamente la altura del pico en función de cada estándar externo conocido. Concentración de etanol. Utilice la función lineal proporcionada por los puntos para interpolar la concentración de etanol de cada muestra de dializado.

Esta figura muestra cromatogramas de ejemplo para tres concentraciones de patrones de etanol y uno para una muestra de dializado de rata recolectada al final de la sesión de autoadministración de etanol. Los picos de etanol deben ser relativamente simétricos, tener tiempos de retención consistentes y una relación señal/ruido mayor que 10. El incumplimiento de estos criterios indica que el sistema requiere mantenimiento, cromatografía de calidad y patrones correctos que produzcan una curva patrón lineal, la cual se utiliza para calcular la concentración de etanol en las muestras de dializado recolectadas de animales que autoadministran etanol durante su período de autoadministración.

Las concentraciones de etanol en el dializado derivadas no se corrigen por la recuperación del sonda in vivo y representan solo una fracción de la concentración tisular de etanol en el cerebro. Si se requiere microdiálisis cuantitativa de etanol, se determina experimentalmente la fracción de extracción del etanol que difunde desde el espacio extracelular hacia la sonda. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente de cuatro a cinco horas si se lleva a cabo adecuadamente.

Esto variará según la duración de la sesión conductual. La finalización exitosa de la fase de microdiálisis del experimento depende en gran medida de la calidad de las fases preparatorias. Es importante, al intentar este procedimiento, asegurarse de que sus ratas hayan sido bien manipuladas y de que las haya habituado a cualquier estímulo potencialmente distractor que pueda ocurrir durante el experimento de diálisis, de modo que la conducta de autominición del animal no se vea afectada.