Presión constante controlada por extrusión Método para la preparación de vesículas de lípidos de tamaño nano-

El objetivo general del siguiente experimento es presentar un método de preparación robusto para vesículas lipídicas de relevancia biológica. Esto se logra mezclando y transfiriendo fosfolípidos a viales de vidrio e hidratándolos con tampón acuoso para crear una suspensión de SLE multilamelar. Como segundo paso, se realiza un método de congelación y descongelación, que posteriormente da como resultado la producción de vesículas Ella a partir de vesículas multilamelares.

A continuación, la suspensión de liposomas se hace pasar a través de un extrusor utilizando la presión óptima determinada para producir vesículas lipídicas homogéneas de un tamaño deseado. Se obtuvieron resultados que muestran tamaños consistentes de vesículas submicrónicas basados en dispersión dinámica de la luz y análisis de seguimiento de nanopartículas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la sonicación y la sedimentación es que este método utiliza un sistema de control de presión con tasas de flujo óptimas de nitrógeno determinadas para la preparación eficiente de vesículas lipídicas de tamaño definido.

Para comenzar este procedimiento, tome un vial de vidrio de 20 mililitros con tapa revestida de teflón, y limpie todo el material de vidrio y las jeringas con cloroformo antes de usarlos para evitar contaminación. Transfiera 100 microlitros de cloroformo de grado reactivo al vial de vidrio utilizando una jeringa de vidrio hermética de 250 microlitros. Añada 30 microlitros de metanol de grado reactivo al mismo vial de vidrio utilizando una jeringa de vidrio hermética de 100 microlitros.

Prepare una solución lipídica de colesterol pop C de dos milimoles transfiriendo 216 microlitros de pop C a 10 miligramos por mililitro, 42 microlitros de 10 miligramos por mililitro, pop e y 20 microlitros de 11 miligramos por mililitro. Soluciones de colesterol al vial de vidrio de 20 mililitros. Evapore los solventes orgánicos utilizando un flujo lento de argón o nitrógeno gaseoso hasta observar una película delgada de lípidos en el fondo del vial. Coloque el vial de vidrio sin tapar en un desecador al vacío durante al menos 30 minutos.

Para eliminar el disolvente residual, transfiera dos mililitros de tampón previamente filtrado a través de un filtro de 0,2 micrómetros al vial de vidrio para hidratar los lípidos. Incube la mezcla a cuatro grados Celsius durante la noche y utilícela dentro de las 48 horas para obtener liposomas de tamaño entre 30 y 100 nanómetros. Congele la suspensión de liposomas en nitrógeno líquido durante 15 segundos.

Luego, descongele la suspensión de liposomas utilizando un bloque calefactor a 42 grados SIU durante aproximadamente tres minutos. Repita el proceso de congelación y descongelación un total de cinco ciclos. La congelación seguida de la descongelación produce Ella Les a partir de vesículas multilamelares y mejora la eficiencia de atrapamiento de lípidos durante la extrusión.

A continuación, prepárese para la extrusión siguiendo las instrucciones de Avastin para armar cuidadosamente el lipo lo más rápido posible. El ensamblaje correcto del extrusor LF 50 es fundamental para prevenir fugas de nitrógeno, lo que afecta los flujos deseados. Para asegurar el éxito, realice los siguientes pasos con cuidado.

Para obtener un sello hermético, coloque la pantalla de soporte de orificio grande en la base del filtro de soporte, seguida por el recipiente circular central, un disco drenaje y una membrana de policarbonato. Coloque la pequeña junta tórica negra encima de la membrana y fíjela a la base del filtro de soporte.

Sujete el extrusor de filtro superior apretando cuatro tornillos en los cuatro orificios correspondientes. Monte la unidad de extrusión con filtro debajo del cilindro grande del extrusor. Añada la solución de liposomas al cilindro superior del barril de extrusión.

Coloque una junta tórica grande, la tapa estrecha, otra junta tórica grande y la tapa circular. Conecte el regulador de gas a la parte superior del cilindro del extrusor y cierre todas las válvulas para evitar fugas de aire, incluida la válvula de alivio de presión. Coloque un vial de vidrio de 20 mililitros o un matraz erlenmeyer de 50 mililitros debajo de la unidad de filtro del extrusor.

Una válvula de seguridad está conectada al regulador y se liberará si la presión supera los 600 PSI. Encienda el gas nitrógeno y abra la válvula de gas conectada al extrusor. Aumente la presión de nitrógeno a 25 PSI para liposomas de 400 nanómetros, a 125 PSI para liposomas de 100 nanómetros, y a 400-500 PSI para liposomas de 30 nanómetros. Observe la suspensión de liposomas hasta que sea expulsada al recipiente mientras es impulsada por el nitrógeno.

Mantenga el flujo de nitrógeno hasta que no se observe líquido. Haciendo pasar a través del filtro del extrusor hacia el frasco de vidrio para realizar el análisis de DLS. Primero, prepare 50 microlitros de una solución de liposomas de 20 micromolar diluida en solución salina tamponada con fosfato o PBS.

Luego encienda la fuente de alimentación y la fuente de la lámpara. Proceda a abrir el software dynapro. Configure el software en el modelo de algoritmo para detectar liposomas del tamaño deseado.

Después de conectar al equipo, pipete 14 microlitros de la muestra de liposomas en la celda de cuarzo e insértela en el portaceldas; presione inicio. Tras aproximadamente 20 a 30 adquisiciones, presione detener. Analice los picos del diámetro promedio de los liposomas registrados en el histograma. El análisis de seguimiento de nanopartículas comienza con la preparación de una solución de liposomas de 500 microlitros a 0,1 micromolar, solubilizada en PBS. Enjuague el compartimiento de la muestra con agua y etanol.

Luego seque el compartimento de muestra con una toalla de papel sin pelusas. Encienda la fuente de alimentación láser y el ordenador, y agregue 300 microlitros de solución de liposomas 0,1 molar al compartimento de muestra. Abra el control de temperatura y el software de análisis de seguimiento de nanopartículas.

Pulse el botón de captura para encender el láser. Utilice los ajustes horizontales y verticales para mover la platina y ajustar el enfoque del microscopio. Establezca la temperatura deseada y el tiempo de grabación.

Pulse el botón de grabación para obtener múltiples cuadros de imagen de las partículas de liposomas durante un tiempo determinado. Analice los picos correspondientes a los tamaños de diámetro de los liposomas en el histograma a medida que se rastrea el movimiento de cada partícula. La DLS es un método establecido que recopila luz dispersada para determinar el diámetro de las partículas y se realizó para determinar los tamaños de los liposomas.

Los liposomas hidratados se extruyeron a través de membranas de policarbonato en distintos tamaños y presiones, tal como se describe en el protocolo escrito. Los diámetros de los liposomas medidos por DLS para un tamaño de poro de 30 nanómetros fueron de 66 ± 28 nanómetros. Para un tamaño de poro de 100 nanómetros fue de 138 ± 80 nanómetros, y para un tamaño de poro de 400 nanómetros fue de 360 ± 25 nanómetros.

Se utilizó una suspensión de microesferas de Irene pulidas de 50 nanómetros como patrón de calibración, en la que se registró un diámetro de 47 ± 16 nanómetros. El porcentaje de politispersidad indica que no hay superposición entre los tamaños de liposomas. Es habitual observar diámetros superiores a 30 nanómetros al utilizar análisis de DLS debido al sesgo conocido de este instrumento hacia partículas más grandes.

A pesar de esta limitación instrumental, la curva de calibración describe una correlación lineal. El análisis de seguimiento de nanopartículas es una tecnología nueva que mide el tamaño de cada partícula mediante observaciones directas de la difusión en un medio líquido, independientemente del índice de refracción o densidad de la partícula. Esta técnica de alta resolución puede utilizarse para complementar la medición de liposomas con DLS; los diámetros registrados por NTA de 95 más o menos 48 nanómetros y 356 más o menos 51 nanómetros para dos soluciones de poliestireno de 100 nanómetros y 400 nanómetros se utilizaron para la calibración.

Las soluciones lipídicas tienen un diámetro más comparable en relación con la DLS, produciendo tamaños promedio de 29 ± 14 nanómetros para un tamaño de poro de 30 nanómetros, 95 ± 17 nanómetros para un tamaño de poro de 100 nanómetros y 359 ± 73 nanómetros para un tamaño de poro de 400 nanómetros. La NTA podría ser una técnica de caracterización más general para cuantificar partículas microscópicas, ya que su sensibilidad permite la medición de partículas de 50 a 1000 nanómetros. La curva de calibración muestra una correlación lineal entre la membrana de policarbonato y el diámetro registrado por NTA. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa muestran cada tamaño de liposoma tras la extrusión, con tamaños de 30, 100 y 400 nanómetros claramente diferenciados entre sí.

El aumento se estableció en 25 000 veces, con una barra de escala que representa 0,5 micrómetros. Se realizó un experimento de curso temporal con tres tamaños de liposomas. Se midió la DLS para cada solución de liposomas inmediatamente después de la extrusión.

Todas las soluciones de liposomas se almacenaron a cuatro grados Celsius durante la noche. Sus diámetros se registraron nuevamente mediante DLS después de una incubación nocturna. Se observó poca o ninguna variación después de un período de incubación de 60 horas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que múltiples pases a través del filtro de extrusión mejorarán la homogeneidad de la solución de Vesco.

Además, recuerde utilizar viales y jeringas de vidrio para la preparación de muestras para evitar la contaminación por lixiviación de tubos de polipropileno por cloroformo.