Lípidos bicapa vesículas Generación Usando Microfluidic Jetting
21 de febrero de 2014
De chorro de microfluidos contra una bicapa lipídica interfaz de gotita ofrece una manera fiable para generar vesículas con el control de la asimetría de la membrana, la incorporación de proteínas de transmembrana, y la encapsulación de material. Esta técnica se puede aplicar para estudiar una variedad de sistemas biológicos en los que se desean biomoléculas compartimentadas.
El objetivo general de este procedimiento es generar vesículas bicapa de fosfolípidos con un mayor control sobre la membrana, la unla, la molaridad, la monodispersión y el contenido interno. Usando cad, se fabrica una cámara a partir de láminas acrílicas y caucho natural. Se produce una bicapa lipídica en suspensión cargando la cámara con lípidos y solución.
A continuación, se instala una inyección de tinta que contiene la solución que se va a encapsular con el aparato de inyección. Una vez que se han establecido los ajustes adecuados, los pulsos de fluido inyectados producirán vesículas de bicapa lipídica. En última instancia, la inyección microfluídica produce vesículas bicapa monodispersas repetibles.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la electroformación, la emulsión o la generación de gotas, es el mayor nivel de control de la membrana, la molaridad unilateral, la monodispersión y el contenido interno. La demostración del procedimiento estará a cargo de Johanna Harrow, una estudiante de posgrado de un laboratorio y la asistencia será Kara Patel, una estudiante de pregrado que utilizará el software CAD. Utilizando software CAD, dibuje una forma para la cámara que se puede hacer de acrílico usando un primer taladro de corte láser, un orificio de 16 pulgadas a través de orificios en ambos lados de la cámara acrílica ensamblada. Que drenará hasta el pozo en forma de infinito.
En segundo lugar, corta un pequeño rectángulo con unas tijeras de una lámina acrílica de 0,2 milímetros para que sirva como parte inferior de la hoja con forma de infinito. Asegúrelo en su lugar con un adhesivo de secado rápido, asegurándose de que el pegamento no entre en contacto con las áreas de visualización. La lámina acrílica debe quedar al ras de la pared de la cámara y fijarse al fondo de la cámara.
En tercer lugar, use adhesivo de secado rápido para pegar una pieza delgada de lámina de caucho natural sobre los orificios perforados. Presiónelos en su lugar con pinzas. Pruebe todas las costuras pegadas en busca de fugas.
No debería haber ninguno. Por último, con una aguja de calibre 23, haga agujeros en la goma a través de los agujeros perforados, la punta de inyección de tinta piezoeléctrica se insertará a través de estos agujeros. Los fosfolípidos reservados deben disolverse en cloroformo y almacenarse a menos 20 grados centígrados.
D-P-H-P-C o DOPC. En esta demostración se utilizan lípidos. Los lípidos disueltos en cloroformo se transfieren a un vial de vidrio mientras se sostiene el vial en ángulo, seque suavemente los lípidos bajo argón o gas nitrógeno.
A continuación, coloque el vial con la tapa ligeramente floja al vacío durante una o dos horas para eliminar el disolvente residual. También se puede usar un desecado para este paso. Ahora solubilice los lípidos en la cubierta final para obtener una concentración final de lípidos de 25 miligramos por mililitro.
Vortex, la solución. Selle brevemente la tapa con param y luego sonique durante 15 minutos. Almacene esta solución a menos 20 grados centígrados.
A continuación, prepare una solución de sacarosa calzada con osmolaridad similar a la fisiológica. Esta es la solución de chorro. Considere agregar una gota de colorante alimentario oscuro o perlas fluorescentes a la solución para agregar contraste o fluorescencia.
Cargue la solución de sacarosa en una jeringa de un mililitro para eliminar el aire atrapado. Agite la jeringa para que las burbujas suban a la abertura del señuelo y puedan ser expulsadas. A continuación, conecte un filtro de 33 milímetros y 0,22 micras a la jeringa y expulse una gota a través del filtro.
Ahora desenrosque el adaptador de señuelo hembra de la inyección de tinta y presiónelo en el extremo del filtro. Expulse un poco de líquido para eliminar el aire atrapado. Por último, coloque la jeringa en la parte superior del líquido de inyección de tinta.
Debe viajar hasta la punta de inyección de tinta si la jeringa se ha colocado correctamente. En primer lugar, monte el conjunto de la jeringa en la platina del microscopio y conecte el controlador de inyección de tinta para este experimento. La platina y la jeringa necesitan un control independiente, ya que la platina y la jeringa se mueven en tres dimensiones para su visualización.
Configura una cámara de alta velocidad capaz de alcanzar al menos 1000 fotogramas por segundo. Configúrelo para usar la activación automática basada en imágenes para iniciar grabaciones. Ahora, asegure la cámara a la plataforma con cinta adhesiva y alinee cuidadosamente la punta de inyección de tinta con el orificio hecho en la lámina de goma en el costado de la cámara.
Primero, ajuste a ojo y luego haga ajustes finos con el microscopio. Una vez alineada, retroceda la jeringa a lo largo de una dimensión para cargar la jeringa en forma de infinito. A continuación, aplique una suave presión al émbolo, de modo que se forme una gota en la boquilla.
Esto proporciona cierta contrapresión inicial. Es necesario configurar los parámetros de inyección. A continuación, los valores específicos para una onda bipolar trapezoidal se presentan en la pantalla, el voltaje aplicado y el número de pulsos de chorro por tamaño de vesícula de control de disparo.
Ahora cargue la cámara con 25 a 30 microlitros de la solución lipídica al final de la década, cubriendo toda la superficie de la forma infinita. Bueno, entonces a cada uno, agregue 25 microlitros de solución de glucosa al borde más externo pipeteando lenta y suavemente, la glucosa no debe mezclarse con la solución lipídica. En 10 minutos, se formará una bicapa lipídica en el centro de la cámara.
La configuración de la bicapa es el paso más crítico, ya que la bicapa es inestable y puede romperse dependiendo de la preparación. Sé paciente. Funcionará una vez que practiques llenar la cámara unas cuantas veces.
Ahora, vuelva a insertar con cuidado la punta de inyección de tinta en la cámara cuando la punta esté a menos de 200 micras de la interfaz de gotas. Bicapa, inicie el proceso de inyección y registre los datos utilizando la inyección de tinta que proporcionó información sobre el proceso de generación de vesículas. Por ejemplo, la variación de la distancia entre la boquilla de inyección de tinta y la bicapa lipídica afectó a la fuerza que deforma la membrana. Cerrar.
La proximidad a la bicapa enfocó la corriente en chorro y evitó que la membrana dispersara la energía lejos del punto de generación de vesículas. Además, el recorrido del vórtice aumentaba con el voltaje aplicado al actuador eléctrico pizo. La formación de vesículas se visualizó como una secuencia de eventos después de su formación.
La estabilidad de las vesículas tendió a variar con el diámetro de la vesícula, siendo las vesículas más pequeñas más estables. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar vesículas violadoras de lípidos mediante chorro microfluídico.
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Descripción general
Este artículo describe un método para generar vesículas de bicapa de fosfolípidos utilizando la proyección microfluídica contra una bicapa lipídica de interfaz de gota. La técnica permite un control preciso sobre la asimetría de la membrana, la incorporación de proteínas transmembrana y la encapsulación de materiales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- biofísica
- Biotecnología
Antecedentes
- Las vesículas de bicapa de fosfolípidos son esenciales para estudiar biomoléculas compartimentalizadas.
- Las técnicas microfluídicas mejoran la reproducibilidad y el control de la formación de vesículas.
- Comprender las propiedades de la membrana es crucial para diversas aplicaciones biológicas.
- La tecnología de inyección puede agilizar el proceso de generación de vesículas.
Objetivo del estudio
- Generar vesículas con características de membrana controladas.
- Facilitar la incorporación de proteínas específicas en la bicapa.
- Permitir la encapsulación de diversos materiales con fines de investigación.
Métodos Utilizados
- Manufactura de una cámara a partir de láminas de acrílico y caucho natural.
- Formación de una bicapa lipídica suspendida mediante la carga de la cámara con lípidos y solución.
- Preparación de un dispositivo de inyección de tinta para encapsular soluciones.
- Establecimiento de los parámetros adecuados para los pulsos de fluido inyectados con fin de crear vesículas.
Resultados principales
- La proyección microfluídica produce vesículas bicapa repetibles y monodispersas.
- El método permite un control preciso sobre las propiedades de las vesículas.
- Se logra eficazmente la encapsulación de materiales.
- Las vesículas pueden adaptarse para diversos estudios biológicos.
Conclusiones
- La proyección microfluídica es una técnica confiable para la generación de vesículas.
- Se mejora el control sobre la asimetría de la membrana y la incorporación de proteínas.
- Este método tiene implicaciones significativas para el estudio de biomoléculas compartimentalizadas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La proyección microfluídica permite un control preciso sobre la generación de vesículas de bicapa lipídica, favoreciendo la producción reproducible de vesículas unilaminares gigantes (GUVs) con una composición de membrana definida y capacidad de encapsulación. Esta capacidad aborda un desafío clave en la investigación de biología sintética y entrega de fármacos al proporcionar una plataforma ajustable para modelar sistemas celulares y probar compuestos bioactivos. El método mejora la confianza predictiva en la validación temprana de objetivos al permitir la interrogación sistemática de procesos dependientes de la membrana.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis terapéuticas mediante el control de la asimetría de la membrana y la incorporación de proteínas transmembrana.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas al generar sistemas de vesículas reproducibles para la aclaración de vías.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al proporcionar lecturas cuantitativas sobre interacciones lípido-proteína y eficiencia de encapsulación.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante la producción de vesículas mono-dispersas con tamaño y contenido interno ajustables.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante parámetros precisos de inyección que controlan la formación de vesículas.
- Preparación para cribado: Destaca la escalabilidad y reutilización de la plataforma para la evaluación confiable de compuestos en múltiples condiciones.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Aborda la relevancia en enfermedades mediante el uso de soluciones con osmolaridad fisiológica y el seguimiento fluorescente para la monitorización de vesículas.
- Alineación Preclínica: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir la encapsulación de candidatos terapéuticos para estudios de estabilidad y liberación.
- Avance Ajustado al Riesgo: Apoya la toma de decisiones al proporcionar resultados cuantificables sobre la estabilidad de las vesículas y el rendimiento dependiente del diámetro.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba inicial de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos, particularmente en ensayos que requieren entornos de membrana controlados y entrega de compuestos encapsulados.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método apoya la comprobación de hipótesis al permitir la variación sistemática de la composición lipídica y la incorporación de proteínas transmembrana para aclarar las dependencias de las vías.
- Selección: Describe la preparación del ensayo mediante la generación de vesículas monodispersas que garantizan una exposición constante a los compuestos y lecturas reproducibles.
- Análisis: Destaca mediciones cuantitativas como el tamaño de las vesículas, la tasa de formación y la eficiencia de encapsulación, que ayudan a los equipos a comparar condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica al permitir la encapsulación de fármacos o biomoléculas para pruebas de estabilidad y perfiles de liberación.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable en lugar de una técnica de uso único, adaptable a múltiples proyectos que requieran plataformas de vesículas sintéticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista en mecanismos relacionados con membranas.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la producción de vesículas para aplicaciones de alto rendimiento.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de continuar/no continuar, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas mediante la eliminación temprana de riesgos en los mecanismos de entrega.
- Impacto en el portafolio: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en datos de rendimiento de las vesículas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microfluídica, manipulación de lípidos y microscopía para el ensamblaje de la cámara y la formación de bicapas.
- Depende de instrumentación que incluye dispositivos piezoeléctricos de inyección de tinta, cámaras de alta velocidad y sistemas de secado al vacío.
- Necesita estandarización entre equipos en cuanto a soluciones lipídicas, parámetros de inyección y procedimientos de alineación de la cámara.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tipos de lípidos, proteínas transmembranales y agentes de encapsulación en diversos sistemas modelo.
- Incluye limitaciones prácticas, como la inestabilidad de la bicapa durante la configuración y la sensibilidad a las vibraciones ambientales durante la inyección.
