On-Chip fenotipificación inflamatoria endotelial

El objetivo de este video es demostrar una técnica de laboratorio en un chip para caracterizar el estado inflamatorio de las células endoteliales. Para comenzar, se cultivan células endoteliales aórticas humanas hasta confluencia sobre un sustrato para cultivo de tejidos, y luego se insertan en un dispositivo de cizallamiento de placa Conan. Las células se tratan con la citocina proinflamatoria TNF alfa y, simultáneamente, se exponen a condiciones diferenciales de esfuerzo cortante durante cuatro horas mediante un control preciso de la rotación del cono sobre el sustrato; el esfuerzo cortante regula una respuesta inflamatoria bien caracterizada a la citocina.

Esto incluye la regulación positiva de moléculas de adhesión como VCA uno e ICAM uno. El sustrato se transfiere a la platina de un microscopio, donde un dispositivo microfluídico A-P-D-M-S se sella al vacío directamente sobre la monocapa, creando canales de flujo. Células monocíticas activadas, líneas celulares THP uno, se hacen fluir sobre el hs preacondicionado, donde se unen en proporción al nivel de expresión de las moléculas de adhesión celular.

El estado inflamatorio del endotelio se determina cuantificando el número total de células THP-1 que están firmemente adheridas. Hola, mi nombre es She D Diverse, y yo soy Greg Foster. Y yo soy Keith Bailey.

Estamos en los laboratorios de los profesores Pastor y Simon del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de California en Davis. Hoy vamos a describir el uso de un enfoque basado en laboratorio en un chip para examinar cuantitativamente la disfunción endotelial y la inflamación. Estas herramientas proporcionan una plataforma para realizar estudios relacionados con la superposición del estrés metabólico con factores hidrodinámicos y la regulación del fenotipo inflamatorio endotelial y la susceptibilidad a la aterosclerosis.

Por lo tanto, nos referimos a nuestros dispositivos como cámaras microfluídicas miméticas vasculares, o VMMC. Estos dispositivos nos permiten cuantificar los resultados inflamatorios en células endoteliales y monocitos bajo condiciones que imitan las presentes en vasos aterogénicos. La VMMC facilita el uso de pequeñas cantidades de reactivos o materiales que pueden estar en suministro limitado.

También pueden construirse en una variedad de diseños y geometrías personalizables, lo que los hace muy adecuados para una amplia gama de aplicaciones. Hoy demostraremos un experimento representativo utilizando nuestro enfoque de laboratorio en un chip. Las monocapas endoteliales humanas serán expuestas a la activación por citocinas bajo esfuerzos cortantes bien definidos.

Demostraremos el uso de la VMC para cuantificar en tiempo real el reclutamiento de células monocíticas humanas a la monocapa, como una lectura funcional de la activación endotelial, utilizando sustratos circulares de tres pulgadas que se fresan a partir de placas de cultivo de tejidos de 100 milímetros. Los sustratos de tres pulgadas se lavan con agua destilada y luego se esterilizan mediante inmersión en etanol al 70 %. Los sustratos estériles se colocan en placas de Petri de 100 milímetros y se dejan secar.

Luego se incuban con colágeno tipo I a una concentración de 100 microgramos por mililitro durante una hora a temperatura ambiente y se lavan con PBS. Las células endoteliales aórticas humanas o HA se suspenden a una concentración de 650.000 células por mililitro. Un mililitro de la suspensión celular se coloca en gotas sobre un sustrato recubierto con colágeno seco y se extiende hasta formar una suspensión uniforme.

Los sustratos con células se colocan entonces en un incubador de 37 grados con 5% de CO₂ y se dejan adherir a la superficie del sustrato. Después de una hora, se añaden nueve mililitros de medio de crecimiento EGM-2 y se permite que las células crezcan hasta formar monocapas con aproximadamente un 90% de confluencia. Las monocapas están listas para ser utilizadas en experimentos de cizalladura posteriores. Las cámaras microfluídicas con mimética vascular se construyen vertiendo PDMS sobre una forma maestra que comprende la geometría del canal deseada.

La base de silicona se vierte en una embarcación de plástico, seguida del agente de curado de silicona en una proporción de 10 a 1 en peso. Luego, el gel de PDMS se mezcla bien, teniendo cuidado de no raspar los bordes de la embarcación para evitar la introducción de virutas de plástico en la mezcla. Las matrices de resistencia fotosensible se limpian con hexano y se preparan para moldear el VMMC.

La mezcla de PDMS se vierte luego sobre la forma matriz y se coloca en una cámara de vacío. En la cámara, el aire se elimina de la mezcla de PDMS y asciende a la superficie después de 15 minutos.

El molde se retira de la cámara y se sopla aire suavemente sobre la superficie de PDMS para eliminar las burbujas de aire restantes del molde. Luego, el molde se cubre y se coloca en un horno a 37 grados durante una hora, tiempo en el cual se permite que el PDMS cure. Retire el gel de PDMS solidificado del horno y realice incisiones circulares alrededor de la cámara utilizando un escalpelo pequeño.

Es fundamental hacerlo gradualmente para evitar el contacto con el material de resistencia fotográfica, ya que esto dañaría el molde maestro. Excise la cámara microfluídica del molde perforando las entradas y salidas de cada canal con una aguja bloqueable de calibre 19. Además, perfore orificios para los tubos de vacío alejados de los canales.

La preparación para la VMMC ya está completa. Pipetee la citocina proinflamatoria TNF alfa en seis mililitros de medio L 15 para obtener una concentración final de 0,5 nanogramos por mililitro. El medio L 15 se utiliza aquí como fluido de cizallamiento debido a su capacidad de amortiguamiento de pH en ausencia de CO2 al 5%.

A continuación, se aspira el medio a una jeringa estéril de 10 mililitros, que se utiliza para cargar el dispositivo de cizallamiento. La monocapa confluyente se transfiere entonces al dispositivo de cizallamiento celular, que ha sido esterilizado con etanol, nivelado y ajustado a la altura deseada del espacio del cono. El sustrato se retira de la placa de Petri y se coloca sobre el bloque patrón de vidrio, centrado e insertado cuidadosamente en la parte inferior de la cámara de alojamiento, de modo que el cono quede directamente encima de las células.

El sustrato se fija mediante el ajuste uniforme de tornillos de acero inoxidable alrededor del bloque patrón. Luego, se carga el medio de cizallamiento en la cámara, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire. A continuación, se utiliza una computadora para ingresar el programa deseado de esfuerzo cortante y se enciende el motor micrométrico separador.

Aquí utilizamos un esfuerzo cortante oscilatorio de cero más o menos cinco dinas por centímetro cuadrado. Después de cuatro horas, se detiene el programa de cizallamiento. Se retira el calibrador de espesor y el sustrato se coloca cuidadosamente de nuevo en la placa de Petri.

Las células ya están listas para el ensayo de adhesión de monocitos. Inmediatamente después del cizallamiento, los monocapas de HA se transportan a la estación del microscopio para el ensamblaje del VMMC. El VMMC se conecta a la manguera de vacío y se sumerge en agua desionizada para eliminar cualquier burbuja de aire atrapada dentro de los canales.

Con la válvula de vacío inicialmente apagada, la cámara se presiona cuidadosamente sobre la monocapa y luego se enciende la válvula de vacío. Es fundamental asegurarse de que no queden atrapadas burbujas de aire dentro de los canales de la cámara. Ahora, se pipetean 80 microlitros de HBSS con calcio y magnesio hacia un reservorio fabricado cortando la punta de una aguja Luer Lock de calibre 19; el líquido se expulsa firmemente presionando la parte superior del reservorio, el cual luego se inserta en el puerto de entrada del VMMC.

Todo el ensamblaje se coloca sobre la platina del microscopio y se encienden la cámara del microscopio y el monitor de video. Se coloca una jeringa de vidrio de 10 mililitros en la bomba de jeringa. A continuación, se conecta el tubo de la jeringa al puerto de salida del VMMC.

El caudal se ajusta para inducir un esfuerzo cortante de una dina por centímetro cuadrado dentro del canal y luego se ejecuta en modo de recarga, de forma que la jeringa extrae fluido desde el depósito a través del canal. Las células P1 estimuladas con SDF1 se suspenden a una concentración de 2 millones de células por mililitro. Dentro de los dos minutos posteriores a la activación del flujo, se añaden 50 microlitros de la suspensión celular al depósito.

De nuevo, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire al alcanzar completamente el flujo. Se captura el video a tres cuadros por segundo y los datos se enumeran utilizando el software Image J. Las células THP-1 adherentes se definen como aquellas que se desplazan menos de la mitad del diámetro celular en 10 segundos.

Aquí demostramos datos que muestran la adhesión de células THP-1 a monocapas de HA estimuladas con TNF-α y acondicionadas bajo un esfuerzo cortante parietal constante y alto de 15 dinas por centímetro cuadrado o bajo un esfuerzo cortante oscilatorio de cero más o menos cinco dinas por centímetro cuadrado. Las monocapas de HA acondicionadas con esfuerzo cortante oscilatorio mostraron una reclutamiento de células THP-1 tres veces mayor en comparación con las monocapas expuestas a un esfuerzo cortante alto. Hoy, demostramos el uso de técnicas personalizables in vitro que pueden combinarse para proporcionar información importante sobre los eventos inflamatorios iniciales subyacentes a la aterosclerosis. Específicamente, cuantificamos resultados asociados con la disfunción endotelial y células expuestas a estímulos inflamatorios bajo condiciones hidrodinámicas bien definidas.

El uso de los CS de VMM nos permite examinar mecanismos específicos que subyacen a las interacciones de adhesión entre células endoteliales y leucocitos. Estos dispositivos también tienen la ventaja de ser flexibles y económicos, y facilitan el uso de materiales que pueden ser limitados en su suministro, como componentes séricos derivados de sujetos humanos. Nuestros estudios que aplican estos dispositivos han incluido investigaciones sobre inflamación inducida por citoquinas, lípidos y RAGE en células endoteliales.

También hemos desarrollado ensayos en chip para examinar los mecanismos de adhesión en múltiples tipos de leucocitos, así como en sangre completa. En última instancia, preveemos que esta tecnología conduzca a enfoques ex vivo para evaluar el riesgo individual de enfermedad cardiovascular mediada por inflamación.