Un protocolo simple para la extracción de hemocitos de orugas silvestres
15 de noviembre de 2012
Hemocitos Insectos llevar a cabo muchas funciones importantes, tanto inmunes y no inmunes, en todas las etapas de desarrollo del insecto. Nuestro conocimiento actual de los tipos de hemocitos y la función proviene de estudios en modelos genéticos de insectos. A continuación, se presenta un método para la extracción, cuantificación y visualización de hemocitos de larvas silvestres.
El objetivo general de este procedimiento es extraer, visualizar y contar los hemocitos de orugas silvestres. Esto se logra primero anestesiando la oruga colocándola sobre hielo, inyectándole una solución tampón que contiene un anticoagulante y devolviendo la oruga al hielo para permitir que los hemocitos reingresen a la circulación antes de la extracción. El segundo paso consiste en realizar una incisión superficial en el extremo posterior de la oruga utilizando un escalpelo limpio.
A continuación, se presiona suavemente la oruga utilizando pinzas blandas. Luego, se aspira la mezcla de solución tampón y hemolinfa mediante una micropipeta y se recoge en un tubo de microcentrífuga. El último paso consiste en mezclar suavemente la solución de hemolinfa con un volumen igual de solución tampón y transferir 10 microlitros de la solución a un hemocitómetro para visualizar y contar el número de hécitos.
En última instancia, este método de extracción de hemocitos puede utilizarse como un procedimiento rápido y eficaz para contar hemocitos de diversas especies de orugas y conservarlos como herramienta para examinar aspectos fisiológicos de la respuesta inmune celular de los insectos. La principal ventaja de esta técnica es que puede emplearse para extraer hemocitos de orugas con una prox muy reducida. Otras orugas modelo se sangran cortando una de las pros, extrayendo así los hemocitos del líquido que sale.
Además, esta técnica puede utilizarse para extraer hemocitos de otras especies de insectos. Este método puede emplearse para responder preguntas clave en el campo de la ecoinmunología, como cómo la respuesta inmune celular de los insectos varía con la calidad de la dieta, la etapa de desarrollo o la exposición a diferentes patógenos. Para comenzar este procedimiento, anestesie las larvas del penúltimo estadio enfriándolas en hielo durante 20 minutos antes de la extracción de hemocitos.
A continuación, inserte el extremo romo de una aguja capilar limpia de calibre 16 en el tubo conectado a una jeringa de vidrio de 20 mililitros. Deje el tubo que contiene la solución de recolección abierto sobre la bancada del laboratorio. Llene lentamente el capilar con aproximadamente de 10 a 15 microlitros de tampón.
Luego, apoye la aguja sobre una bola de arcilla que se coloca junto al microscopio de disección. Coloque la oruga en una placa de Petri. El insecto debe colocarse de lado para que las esferas sean claramente visibles.
Mientras se observa bajo un microscopio estereoscópico, sujete la oruga en su lugar con un par de pinzas y coloque la aguja cerca de una de las esferas, donde la cutícula del insecto generalmente es más blanda. Luego, presione suavemente la aguja capilar contra el cuerpo del insecto. Una vez que la aguja haya penetrado la cutícula, inyecte el volumen total de solución en la oruga.
El cuerpo de la oruga se hinchará tras la inyección, pero no debería reventar ni supurar. Devuelva la oruga a la placa de Petri con hielo. Coloque el insecto en posición dorsal para evitar que el tampón salga por la herida.
Repita las inyecciones para cada oruga utilizada en la extracción de hemolinfa. Luego, deje que todos los insectos se enfríen sobre hielo durante 30 minutos. Ahora, coloque la oruga en una placa de Petri bajo el microscopio estereoscópico.
Realice cuidadosamente una incisión superficial de aproximadamente dos a tres milímetros de longitud en la región posterior de la oruga, utilizando un escalpelo estéril sin dañar el intestino ni otros órganos internos. A continuación, presione suavemente la oruga usando un par de pinzas plásticas flexibles mientras recoge aproximadamente de 10 a 20 microlitros de la mezcla de hemo linfa con una punta de pipeta de 10 microlitros. Nuevamente, tenga cuidado de no lesionar los tejidos internos.
Después de eso, deseche los restos de las orugas. Recoja la hemolinfa de cada oruga en tubos microcentrífugos de 0,5 mililitros, silanizados y etiquetados individualmente. Luego agregue aproximadamente de 10 a 20 microlitros de la solución de incubación a cada muestra de hemolinfa recolectada de una oruga individual.
Mantenga las muestras de hemolinfa sobre hielo en todo momento en este paso. Mezcle la muestra de hemolinfa y la solución de incubación inmediatamente antes del recuento. He cito.
Este tratamiento permite la separación adecuada de los hemocitos y evita la formación de grumos. Utilice una punta de pipeta limpia para transferir 10 microlitros de la muestra de hemolinfa mezclada con la solución de incubación sobre un hemocitómetro. Luego, usando un microscopio compuesto, cuente y registre el número de hemocitos en al menos 15 de los cuadrados grandes de la cuadrícula central del hemocitómetro.
Agregue estos valores para obtener una suma total del número de hemo citas en los 15 cuadrados. A continuación, enjuague cuidadosamente el hemo citómetro y su cubreobjetos utilizando una botella lavadora con agua destilada y desionizada. Luego séquelos con toallitas Kim.
Repita los procedimientos para el resto de las muestras de hemo linfa y calcule el número promedio de hemo citos por mililitro de volumen de hemo linfa para cada oruga. La imagen de microscopía de campo claro muestra los hemo citos extraídos de orugas de nucle hin ai a un aumento de 20 x. Tras seguir este procedimiento, los hemo citos recolectados podrían utilizarse para estudiar la respuesta inmune celular y establecer ensayos como fagocitosis y cap, encapsulamiento selectivo y actividad de pH oxidasa.
Además, el ARN, el ADN y las proteínas pueden recolectarse sin usar para ensayos posteriores, con el fin de estudiar estas respuestas inmunitarias celulares en insectos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inyectar orugas con el propósito de extraer hemolinfa y cómo recolectar hemolinfa que contenga hemocitos viables.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo presenta un método para extraer, cuantificar y visualizar hemocitos de orugas silvestres. Los hemocitos desempeñan funciones cruciales tanto en procesos inmunes como no inmunes durante el desarrollo de los insectos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología de insectos
- Función de los hemocitos
- Biología del desarrollo
Antecedentes
- Los hemocitos son vitales para las respuestas inmunitarias de los insectos.
- Comprender los tipos de hemocitos ayuda a estudiar la biología de los insectos.
- El conocimiento actual se basa principalmente en modelos genéticos.
- Este estudio se centra en orugas silvestres para ampliar el conocimiento existente.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para la extracción de hemocitos.
- Visualizar los hemocitos para comprender mejor sus funciones.
- Cuantificar los hemocitos para evaluar su papel en la fisiología de los insectos.
Métodos Utilizados
- Anestesiar las orugas en hielo.
- Inyectar una solución tampón con anticoagulante.
- Realizar una incisión superficial para facilitar la extracción de hemocitos.
- Aspirar la hemolinfa y mezclarla con tampón para su análisis.
Resultados principales
- Extracción y visualización exitosas de hemocitos.
- Cuantificación de hemocitos utilizando un hemocitómetro.
- Se demostró la viabilidad del método en orugas silvestres.
- Proporcionó información sobre la circulación y función de los hemocitos.
Conclusiones
- El método permite un estudio efectivo de los hemocitos en orugas silvestres.
- Mejora la comprensión de las respuestas inmunitarias de los insectos.
- Puede aplicarse a otras especies de insectos para estudios comparativos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La extracción y cuantificación confiable de hemocitos de orugas silvestres permite el estudio de mecanismos inmunitarios innatos en especies de insectos no modelo, apoyando la validación temprana de objetivos en inmunología de insectos. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo estandarizado para aislar células inmunitarias, facilitando estudios comparativos y ensayos funcionales relevantes para la investigación traslacional y la eco-inmunología. El método mejora la confianza predictiva en la caracterización de la respuesta inmunitaria, orientando decisiones ajustadas al riesgo en líneas de descubrimiento que involucran modelos de insectos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar la diversidad y función de las células inmunitarias de insectos en especies no modelo.
- Apoya la desactivación de riesgos biológicos al proporcionar acceso a células inmunitarias primarias para estudios mecanicistas.
- Facilita la validación funcional de objetivos mediante ensayos inmunológicos posteriores.
- Mejora la confianza predictiva en las hipótesis sobre respuestas inmunitarias en investigaciones basadas en insectos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara muestras validadas de hemocitos para ensayos inmunitarios cuantitativos y funcionales.
- Normaliza la extracción y el recuento de células, favoreciendo la reproducibilidad entre experimentos.
- Permite la preparación escalable de hemocitos para el cribado de efectos de patógenos o compuestos.
- Proporciona números celulares confiables para la normalización de ensayos y análisis comparativos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con estudios de ecoinmunología al permitir el perfilado inmunitario en poblaciones silvestres.
- Apoya la continuidad desde la recolección de campo hasta ensayos funcionales basados en laboratorio.
- Facilita el avance ajustado al riesgo de modelos de insectos para investigación traslacional.
- Proporciona una reducción mecanicista de riesgos para estudios de modulación inmunitaria e interacción con patógenos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de extracción de hemocitos se sitúa en la intersección entre el descubrimiento inicial y el desarrollo de ensayos, permitiendo estudios de células inmunitarias basados en hipótesis en modelos de insectos silvestres.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la diversidad y función de las células inmunitarias en insectos no modelo.
- Tamizaje: Proporciona preparaciones estandarizadas y cuantitativas de hemocitos para ensayos inmunitarios posteriores.
- Análisis: Ofrece recuentos celulares y datos morfológicos para comparar las respuestas inmunitarias entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta la recolección de campo con el perfilado inmunitario en laboratorio para estudios de ecoinmunología e investigaciones comparativas.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un protocolo reutilizable adaptable a diversas especies de lepidópteros y otros insectos relacionados.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en estudios de células inmunitarias y reduce la ambigüedad mecanicista en la inmunología de insectos.
- Valor operativo: Estandariza la extracción y el recuento de hemocitos para flujos de trabajo reproducibles y escalables.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de continuar o no continuar en investigaciones inmunológicas basadas en insectos y en líneas de trabajo de ecoinmunología.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de modelos de insectos para estudios funcionales y traslacionales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de insectos y técnicas de microdisección.
- Necesita acceso a microscopios estereoscópicos y compuestos, hemocitómetros y herramientas estériles.
- Exige estandarización entre equipos para los protocolos de recolección de muestras y de conteo celular.
- Adaptable a diversas especies de lepidópteros y otros insectos relacionados con modificaciones menores.
- El rendimiento de la muestra y la viabilidad celular pueden variar según la especie y la etapa de desarrollo.
