Un ensayo Galvanotaxis por análisis de la cinética precursoras neurales migración celular en un campo aplicado externamente directo Corriente Eléctrica

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la migración de células precursoras neurales derivadas de adultos en presencia de un campo eléctrico de corriente continua. Esto se logra primero aislando y cultivando células precursoras neurales subependimarias del ratón adulto. El siguiente paso consiste en preparar cámaras Galvan Axxis y transferir las células precursoras neurales a las cámaras.

El último paso consiste en aplicar un campo eléctrico de corriente continua a través de la cámara Galvan Axxis y realizar imágenes de lapso de tiempo para observar la migración de los precursores neuronales. En última instancia, la microscopía de imágenes de lapso de tiempo captura las propiedades galvanotácticas de los precursores neuronales en sus estados diferenciado y no diferenciado. Aunque este método puede proporcionar información sobre la galvanosis de las células precursoras neuronales, también puede aplicarse a otros sistemas, como un modelo de accidente cerebrovascular en ratón para el reclutamiento de precursores neuronales hacia sitios de lesión con el fin de potenciar la reparación neuronal.

El procedimiento será demostrado por Rob Pilley, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Al iniciar este procedimiento, las NPCs deben haber estado en cultivo durante siete días, de modo que los neuroesferas primarias flotantes estén listas para ser recolectadas. Cuando sea necesario, comience a preparar tres cámaras Galvan Axxis colocando tres vidrios cuadrados.

Primero, colocar las laminillas en un frasco con ácido clorhídrico normal 6 durante la noche. A primera hora del día siguiente, preparar el gel Matra para que se descongele lentamente sobre hielo. Después de cuatro horas, estará listo para usarlo en la construcción de la cámara.

Primero, utilice un cortador de vidrio con punta de diamante para cortar seis tiras rectangulares de vidrio a partir de cubreobjetos cuadrados nuevos número uno. Transfiera los cubreobjetos cuadrados lavados con ácido y las tiras rectangulares a una cabina de flujo laminar.

Lave las tiras de vidrio con etanol al 70 % seguido de agua estéril para cultivo de tejidos. Deje que sequen al aire o séquelas sobre papel sin pelusas. A continuación, aplique grasa al vacío alrededor del perímetro de una superficie de cada portaobjetos cuadrado de vidrio y séllelos a la base de plástico de 60 milímetros.

Placas de Petri. Aplique grasa para vacío en un lado de las tiras de vidrio rectangulares y séllelas en los bordes opuestos del cuadrado. Use portaobjetos de vidrio para crear cuadrados con una ranura central en el centro de cada placa.

Sterilice con luz UV estos cuadrados o cámaras de vidrio modificados durante al menos 15 minutos en una cabina. A continuación, pipetee entre 250 y 300 microlitros de poliolisina en la depresión central de las cámaras. Luego incube las cámaras a temperatura ambiente durante dos horas, aproximadamente 15 minutos antes de que finalice la incubación.

Prepare la solución de Matrigel después de dos horas, aspire la polilisina y lave las ranuras centrales con un mililitro de agua autoclaveada. Luego, pipete de 250 a 300 microlitros de la solución de Matrigel sobre las ranuras centrales e incube las cámaras a 37 grados Celsius durante una hora. Tras la incubación, aspire la solución de Matrigel.

Luego, lave suavemente las ranuras centrales con uno a dos mililitros de medio libre de suero (SFM). Ahora, agregue mediante pipeta 100 microlitros de E-F-H-S-F-M o F-B-S-S-F-M a las ranuras centrales para prepararlas para las células cultivadas. A continuación, transfiera mediante pipeta cuatro a cinco mililitros del cultivo que contiene neuroesferas a un nuevo plato de Petri de 60 milímetros.

Luego, coloque la placa de Petri sobre la platina del microscopio de recuento bajo el objetivo de visualización de cinco aumentos. Utilice una pipeta P10 para transferir suavemente de cinco a ocho neuroesferas completas a la ranura central de cada cámara. Hasta cuatro.

Los neuroesferas pueden transferirse de inmediato, pero no las disociar con las neuroesferas en las hendiduras centrales. Extiéndalas cuidadosamente alrededor sin alterar el sustrato de matrigel. Luego, añada un volumen adicional de 150 microlitros de E-F-H-S-F-M o F-B-S-S-F-M sobre las hendiduras centrales.

Ahora cultive las células en un incubador humedecido. Después de 17 a 20 horas en cultivo, los NPCs no diferenciados estarán disponibles tras 69 a 72 horas. En cultivo, los NPCs diferenciados estarán disponibles.

Bajo el microscopio invertido, seleccione la cámara con las mejores células para el análisis de migración mediante imágenes de células vivas. Las células deben ser redondas, casi completamente disociadas de sus neuroesferas y aún no haber formado, o apenas haber comenzado a formar, prolongaciones en la cabina. Prepare una cubierta de cámara.

Lave una cubreobjetos cuadrada de vidrio con etanol al 70%, luego con agua autoclavada y aplique una tira de grasa al vacío en dos bordes paralelos. Ahora cubra la cámara. Primero, aspire el medio de cultivo del surco central y luego selle rápidamente la cubreobjetos sobre las paredes rectangulares como si fuera un techo.

A continuación, utilizando la acción capilar, cargue 100 microlitros de medio fresco en la ranura central. Ahora utilice grasa de vacío para crear bordes para charcos de medio de cultivo. En cada extremo de la ranura central del sistema de microscopía de células vivas, tenga preparados tubos de gel de agarosa, electrodos de plata y cloruro de plata, y dos placas de Petri de 60 milímetros para usar.

Como reservorios de medio de cultivo, deje que las cámaras reposen dentro del ambiente de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 20 a 30 minutos. Durante este tiempo, prepare las tapas de los dos platos de Petri vacíos y la tapa del plato de Petri de las cámaras Galvan Axxis perforando orificios en ellas con una Dremel o una pipeta de herramienta, agregue de 1,5 a dos mililitros de medio en cada lado del surco central y añada de siete a ocho mililitros de medio SFM en cada plato de Petri vacío. Coloque un plato de Petri a cada lado del surco central de la cámara y coloque un electrodo en cada plato.

Cruce el espacio entre la cámara y las placas de Petri para establecer la continuidad eléctrica. Con los puentes de gel Agros, conecte los electrodos a una fuente de alimentación externa con un medidor M en serie para medir la corriente eléctrica y encienda la fuente de alimentación. Utilice un voltímetro para medir directamente la intensidad del campo eléctrico a través del canal central.

Ajuste la salida de la fuente de alimentación según sea necesario. Ahora inicie el módulo de lapso de tiempo en el sistema de imagen. En el software Axio Vision, seleccione adquisición multidimensional y haga clic en ver.

Para los canales, seleccione el canal seis y haga clic en T para lapse de tiempo. En la configuración, establezca el intervalo del lapse de tiempo en un minuto y la duración en ocho horas en los campos antes y después del punto temporal; seleccione el punto temporal anterior y posterior. Ahora haga clic en iniciar y permita que el experimento se ejecute durante el tiempo deseado. Tras la finalización del ensayo, continúe con el análisis de inmunohistoquímica (IHC).

El análisis cinemático reveló que en presencia de un DCEF de 250 milivoltios por milímetro, los NPCs no diferenciados exhiben una galvanoaxia altamente dirigida y rápida hacia el cátodo; a esta intensidad de campo, más del 98 % de los NPCs no diferenciados migraron durante las seis a ocho horas completas en las que fueron observados. En ausencia de un DCEF, se observó un movimiento aleatorio de las células.

Dado que las células muertas no migran, esto sugiere que permanecen viables durante este período. En ausencia o presencia de A-D-C-E-F, los fenotipos diferenciados experimentaron una migración insignificante, tanto en presencia como en ausencia de subconjuntos de células diferenciadas A-D-C-E-F. Se observaron procesos alargados que tendían a alinearse perpendicularmente a la dirección del DCEF, pero no se observó una translocación notable del cuerpo celular.

La inmunotinción confirmó que las NPCs mantuvieron una expresión positiva del marcador de precursor neural nestin tras seis horas de exposición al campo eléctrico de corriente continua. En los ensayos que involucran NPCs inducidas a diferenciarse en fenotipos maduros, la mayoría de las células expresan el marcador de astrocito maduro proteína ácida fibrilar glial o GFAP tras seis horas de exposición al CDEC. Tras seguir este procedimiento, se pueden obtener conocimientos sobre los mecanismos celulares implicados en la transducción del campo eléctrico de corriente continua en motilidad celular mediante el uso de modelos genéticos con eliminación génica.

O señor, un ejemplo.