Electricidad-libre, el ácido nucleico secuencial y aislamiento de las proteínas
15 de mayo de 2012
Una herramienta y química se describen para aislar secuencialmente ácidos nucleicos seguido de proteínas a partir de una muestra sin la necesidad de electricidad. La herramienta consta de un sorbente a cabo dentro de una pipeta de transferencia, mientras que las químicas de aislamiento se basa en los principios de extracción en fase sólida. Las macromoléculas aisladas pueden ser analizados mediante ensayos de inmuno-basados y basado en la PCR.
El objetivo general de este procedimiento es aislar ácidos nucleicos listos para PCR y proteínas inmunorreactivas a partir de una muestra, sin necesidad de electricidad ni infraestructura de laboratorio. El aislamiento de ácidos nucleicos en proteínas comienza mezclando la muestra con guanidina y tiocianato para lisar la muestra y pasando la mezcla a través del sorbente en la pipeta de extracción. Cinco veces después del quinto y último paso por el sorbente, coloque la mezcla en tampón de extracción de proteínas y déjela aparte para aislar la proteína inmunorreactiva.
A continuación, se lavan el sorbente y los ácidos nucleicos unidos pasando etanol al 95 % sobre el sorbente. Varias veces, el sorbente y los ácidos nucleicos unidos se secan luego pasando aire ambiente sobre el sorbente durante cinco minutos. El último paso para el aislamiento de ácidos nucleicos listos para PCR consiste en eluir los ácidos nucleicos del sorbente utilizando 250 microlitros de tris u otra solución acuosa similar para el aislamiento de la proteína inmunorreactiva.
Después de mezclar la muestra y el tampón de extracción de proteínas, utilice una segunda pipeta de extracción y pase la mezcla sobre el sorbente 15 veces. El siguiente paso consiste en lavar el sorbente con la proteína unida pasando etanol al 95 % sobre el sorbente varias veces. Luego, el sorbente y la proteína unida se secan pasando aire ambiente sobre el sorbente durante cinco minutos.
El paso final del protocolo consiste en eluir la proteína del sorbente. En última instancia, la pipeta de extracción utilizada en este procedimiento permite el aislamiento, sin necesidad de electricidad, de ácidos nucleicos listos para PCR y proteínas inmunorreactivas. Hola, mi nombre es Dave Pawlowski.
Soy científico investigador principal en Kubrick Incorporated en Buffalo, Nueva York, y hoy aprenderemos una técnica que permitirá aislar simultáneamente proteínas y ácidos nucleicos en línea, sin necesidad de una centrífuga, un vórtex ni ningún otro equipo de laboratorio adicional. Antes de la lisis de la muestra, asegúrese de que las muestras estén en forma líquida. Si la muestra es sólida, por ejemplo, alimento o heces, debe suspenderse en un medio líquido como agua o solución salina tamponada con fosfatos.
Mezcle 500 microlitros de la muestra con 500 microlitros de tiocianato de guanidinio seis molar en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, presione la perilla de una pipeta de extracción, expulsando el aire ambiente. Aspire todo el mililitro de muestra dentro de la pipeta de extracción sobre el material absorbente permitiendo que la perilla se expanda lentamente.
Invierta la herramienta de extracción de forma que las perlas del sorbente y la muestra drenen hacia el bulbo. Muela las perlas del sorbente con la muestra en el bulbo. Tenga cuidado de no expulsar la muestra fuera de la pipeta de extracción.
Invierta la pipeta de extracción y expulse la muestra en el tubo original de 1,5 mililitros. Aspire toda la muestra de un mililitro hacia la pipeta de extracción, pasando por el material absorbente a un ritmo moderado. Teniendo cuidado de mantener el material absorbente en el cuello de la pipeta de extracción, expulse toda la muestra en el tubo de 1,5 mililitros presionando el bulbo.
Repita este proceso, pasando la muestra a través del sorbente otras cuatro veces para un total de cinco pasos. Después del quinto paso por el sorbente, expulse toda la muestra de un mililitro en cuatro mililitros del tampón de extracción de proteínas en un tubo cónico de 15 mililitros. Mezcle el tubo invirtiéndolo, luego ciérrelo y déjelo apartado para usarlo más adelante.
Lave los ácidos nucleicos aislados pasando un mililitro de etanol al 95 % sobre el sorbente tres veces, devolviendo el etanol a su tubo original. Tras el último paso, repita el lavado tres veces utilizando un segundo mililitro de etanol al 95 %. El siguiente paso del procedimiento es secar el sorbente; la recuperación de ácidos nucleicos es mejor cuando el sorbente está seco.
Sé que este paso es tedioso. Sin embargo, si completa este paso dentro del período recomendado, sus resultados serán mejores. Presione y suelte la perilla durante cinco minutos.
Pase aire ambiente a través de la pipeta de extracción para secar los ácidos nucleicos y el lecho del sorbente, y limpie el etanol residual de la punta de la pipeta de extracción. Utilizando una toalla Kim, recupere los ácidos nucleicos pasando 250 microlitros de triss 10 milimolar sobre el sorbente cinco veces. El tampón triss puede sustituirse por cualquier otra solución acuosa adecuada, como PBS.
La solución resultante contiene los ácidos nucleicos para realizar primero la extracción de proteínas; mezcle la muestra en tampón de extracción de proteínas que se había reservado previamente invirtiendo el tubo, pasando aproximadamente de dos a tres mililitros de esta muestra de cinco mililitros sobre el sorbente de una nueva extracción. Pase toda la muestra con una pipeta al mismo tubo cónico de 15 mililitros. Tenga cuidado de mantener el sorbente en el cuello de la pipeta de extracción.
Repita este proceso. Pase la muestra a través del sorbente 15 veces. Lave el sorbente y la proteína retenida pasando un mililitro de etanol al 95 % sobre el lecho del sorbente tres veces, expulsando el etanol hacia el tubo original; luego realice tres lavados adicionales utilizando un segundo mililitro de etanol al 95 %.
El siguiente paso del procedimiento consiste en secar nuevamente el sorbente. Como ocurre con los ácidos nucleicos, la recuperación de proteínas se realiza mejor cuando el sorbente está seco. Durante un período de tiempo más prolongado.
Presione y suelte la perilla durante cinco minutos, haciendo pasar aire ambiente a través de toda la pipeta de extracción. Para secar el lecho del sorbente proteico, limpie el etanol residual de la punta de la pipeta de extracción. Utilizando una toalla Kim, recupere la proteína haciendo pasar 250 microlitros de PBS sobre el sorbente cinco veces.
El tampón PBS puede ser reemplazado por cualquier otra solución acuosa adecuada, como tris 10 milimolar, pH 6,8. La solución resultante contiene el contenido proteico de la muestra. Los genes de la toxina shiga asociados con la cepa de Escherichia coli enterohemorrágica O157:H7 EDL933 se amplificaron a partir de un procedimiento de extracción de ácidos nucleicos y proteínas utilizando la pipeta de extracción.
Los genes de la toxina Shiga, toxina Shiga uno y toxina Shiga dos, se encuentran en fagos bacterianos lambda tipo templados y en fagos bacterianos defectuosos bajo el control del promotor PR. La activación de la respuesta SOS en E. coli conduce a la inducción del profago y/o a la producción de toxinas. En este caso, se observa un aumento considerable en la amplificación del gen de la toxina Shiga dos cuando la respuesta SOS se induce mediante mitomicina C en comparación con el control no tratado.
Esto sugiere la inducción de profagos y la replicación del genoma fágico. La proteína recuperada de los experimentos de aislamiento de proteínas de ácidos nucleicos descritos en el video es inmunorreactiva. La fracción proteica aislada se aplicó a tiras de ensayo inmunocromatográfico rápido para E. coli O157.
Los controles muestran una identificación positiva en todas las muestras que contienen E. coli O157 con o sin inducción de toxina Shiga, como se observa por la presencia de dos bandas rojas. Los datos también muestran resultados positivos para aquellas muestras que contienen E. coli O157 y que fueron procesadas para ácidos nucleicos y proteínas utilizando la pipeta de extracción. Estos datos indican que la proteína aislada de cada muestra es inmunoactiva, provocando así una respuesta positiva.
La proteína aislada es adecuada para electroforesis, como se muestra aquí en un gel de acrilamida al 8 % teñido con kumasi cargado con BSA aislada de isotiocianato de gudina seis molar. Mediante el protocolo de extracción, pipeteo y procedimientos asociados, la movilidad electroforética de la proteína aislada es idéntica a la de las muestras control. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de 20 minutos.
Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo aislar proteínas y ácidos nucleicos del dispositivo sencillo. Gracias por tomarse el tiempo para ver nuestro video.
Información general
Este artículo describe una herramienta novedosa y químicas para el aislamiento secuencial de ácidos nucleicos y proteínas de muestras sin electricidad. El método utiliza un sorbente dentro de una pipeta de transferencia, empleando principios de extracción en fase sólida para un aislamiento eficaz.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Bioquímica
- Biología Molecular
- Química Analítica
Fundamentos
- Los métodos tradicionales para aislar ácidos nucleicos y proteínas a menudo requieren electricidad y equipo especializado.
- Este estudio presenta una alternativa sin electricidad para el procesamiento de muestras.
- El método es aplicable a varios tipos de muestras, incluyendo muestras sólidas.
- Utiliza tiocianato de guanidina para la lisis de muestras.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método para aislar ácidos nucleicos listos para PCR y proteínas inmunoreactivas.
- Eliminar la necesidad de infraestructura de laboratorio durante el proceso de aislamiento.
- Proporcionar un protocolo fácil de usar que se puede realizar en entornos de campo.
Métodos utilizados
- Lisis de muestras con tiocianato de guanidina.
- Paso secuencial de muestras sobre un sorbente en una pipeta de extracción.
- Lavado de ácidos nucleicos y proteínas unidos con etanol.
- Elución de ácidos nucleicos y proteínas usando soluciones acuosas.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de ácidos nucleicos y proteínas sin electricidad.
- El protocolo permite la extracción de ácidos nucleicos listos para PCR.
- Las proteínas inmunoreactivas se aislaron eficazmente para análisis adicionales.
- Demostró aplicabilidad a varios tipos de muestras, incluyendo muestras sólidas.
Conclusiones
- El método desarrollado proporciona una solución práctica para el aislamiento de ácidos nucleicos y proteínas.
- Es adecuado para su uso en entornos con recursos limitados.
- Este enfoque puede facilitar la investigación en diversos campos biológicos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation enables rapid, field-based molecular analysis where laboratory infrastructure is unavailable. This capability supports early pathogen detection, dual biomarker validation, and streamlined sample logistics in resource-limited or decentralized settings. The approach enhances predictive confidence by allowing direct genomic and proteomic corroboration from a single sample, reducing ambiguity at critical discovery and diagnostic inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of infectious agents in diverse environments.
- Supports functional target validation by providing both nucleic acid and protein outputs from the same sample.
- Facilitates mechanistic de-risking through multi-modal biomarker analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nucleic acid and protein extracts for downstream PCR and immunoassay workflows.
- Improves assay reproducibility by minimizing sample handling and split-sample variability.
- Enables rapid, scalable screening in field or low-resource settings.
Translational & Preclinical Research
- Aligns field-collected samples with translational biomarker strategies by supporting both genomic and proteomic readouts.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving sample integrity and analytical flexibility.
- Reduces risk of false negatives by enabling redundant molecular confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, field diagnostics, and preclinical validation by enabling robust sample collection and dual-analyte extraction outside traditional labs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking for pathogen and biomarker identification.
- Screening: Delivers assay-ready nucleic acids and proteins for immediate or deferred analysis.
- Analytics: Provides quantitative, corroborative outputs for cross-platform comparison and decision-making.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and sample continuity from field to lab.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, reusable extraction platform adaptable to multiple sample types and workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity by enabling dual molecular analysis.
- Operational Value: Standardizes extraction protocols and eliminates dependency on electricity or specialized equipment.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency in decentralized or resource-limited settings.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling robust, field-compatible sample analysis.
Implementation Considerations
- Requires basic molecular biology expertise for sample handling and extraction steps.
- Minimal instrumentation needed; relies on proprietary extraction pipettes and standard buffers.
- Cross-team standardization is facilitated by unified protocols for nucleic acid and protein isolation.
- Adaptable to a wide range of sample types, including liquids and solids suspended in buffer.
- Throughput is limited by manual processing; best suited for rapid, point-of-care, or low-to-moderate volume applications.
