Análisis y construcción de estructuras de ácidos nucleicos con 3DNA

El objetivo general de este procedimiento es poner a disposición de científicos de laboratorio y otros investigadores la suite de programas 3D NA para estudiar la organización espacial del ADN y del ARN mediante herramientas computacionales de vanguardia. Esto se logra primero descargando el software desde el foro 3D NA e instalándolo en un ordenador local. El segundo paso consiste en analizar una estructura representativa de ADN a nivel de los pasos de pares de bases constituyentes.

A continuación, la misma estructura de ADN se modifica a nivel de pares de bases y luego se reconstruye utilizando los nuevos parámetros definidos para los pasos de pares de bases. El paso siguiente es el análisis de un gran conjunto de estructuras relacionadas. El paso final consiste en alinear un conjunto de estructuras de ADN relacionadas en un marco de referencia común para visualizar las distorsiones globales de las estructuras.

En última instancia, las herramientas 3D NA se utilizan para examinar cómo cada par de bases individuales, incluidos aquellos unidos a fármacos y proteínas, contribuyen al plegamiento general del ADN y para identificar los sitios y direcciones de distorsiones globales significativas. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que el software es robusto y ampliamente aplicable a una variedad de estructuras diferentes que contienen ácidos nucleicos. El método puede ayudar a responder preguntas clave en bioquímica y biofísica, como cómo se organizan los genomas en tres dimensiones y qué tipo de deformación puede adoptar el ADN.

Para comenzar la instalación del paquete de software, conéctese al sitio web de DA tres@xthreed.org y haga clic en el enlace al foro de 3D NA. Dentro del foro, seleccione el enlace de registro y siga las instrucciones para crear una nueva cuenta.

Una vez que se haya establecido un nombre de usuario y una contraseña, inicie sesión en el foro, seleccione el enlace de descargas en la sección de bienvenida y, en la nueva página, elija la descarga de 3D NA. Haga doble clic en el archivo tar gz para crear una carpeta denominada X 3D NA dash V 2.1, que contiene el software 3D NA. Abra la aplicación de terminal, que normalmente se encuentra en utilidades en una Macintosh, y acceda al directorio X 3D NA dash V 2.1.

Ejecute el script de configuración necesario para que el ADN 3D funcione correctamente. Todos los comandos utilizados en este video se pueden encontrar en el protocolo de texto. A continuación, copie la configuración de exportación de dos líneas que aparece impresa en la pantalla.

Si el usuario ha colocado el software en el directorio de aplicaciones, las dos líneas deben aparecer como se muestra aquí. Abra la aplicación de edición de texto ubicada en el directorio de aplicaciones. En el menú Formato, seleccione Convertir en texto sin formato.

Si existe un archivo BRC, ábralo en modo texto, edite y pegue la configuración de exportación al final del archivo. Si no existe un archivo bash RC, pegue la configuración de exportación en un archivo nuevo y guárdelo con el nombre bash RC en el directorio principal. Para que los nuevos ajustes estén disponibles, ejecute el archivo Bash RC recién guardado dentro del programa de terminal.

Este video demuestra el análisis de una estructura representativa de ácido nucleico, el ADN unido a la proteína HBB de la bacteria Borrelia burgdorferi. El primer paso en el análisis 3D del AN es la creación de un archivo que enumere todas las bases emparejadas. Esto se realiza escribiendo un comando para aplicar el programa FindPairs a la estructura atómica almacenada en el archivo np2, mp2 pdb.

El siguiente paso en el análisis consiste en determinar los parámetros geométricos que caracterizan la estructura. El comando analyze toma como entrada el archivo de pares de bases y crea varios archivos de salida que aparecen en el directorio de trabajo. Los valores geométricos pueden entonces calcularse escribiendo analyze two MP two bps.

Los archivos de salida generados incluyen dos MP dos sal, que contiene una descripción general de los parámetros calculados, y bpco paso par, que contiene una lista de los parámetros del cuerpo rígido. Además del análisis de una estructura de ácido nucleico, el software 3D NA proporciona la capacidad de construir un modelo estructural a partir de parámetros de cuerpo rígido utilizando el comando reconstruir para crear un modelo atómico aproximado, que incluye coordenadas tanto para los átomos del esqueleto como para los de las bases. Escriba el comando que aparece en el texto. Este comando indica a 3D NA que introduzca una conformación estándar de esqueleto BDNA en la construcción de modelos a partir de parámetros de cuerpo rígido.

Entonces se puede construir un modelo de doble hélice con los parámetros de cuerpo rígido encontrados en la estructura H-B-B-D-N-A escribiendo el comando apropiado. El archivo de parámetros bpco step se puede editar para generar una estructura modificada. Aquí, se modifican los ángulos de rotación extremos formados en los dos sitios de mayor curvatura.

Luego, la estructura se construye utilizando el conjunto modificado de parámetros de paso como archivo de entrada. Los dos modelos pueden visualizarse con un visor molecular estándar, a diferencia del análisis de una estructura que contiene un solo ácido nucleico. Esta parte del video mostrará cómo analizar un gran conjunto de estructuras en un grupo de archivos, comenzando con los nombres MD_subrayado_conjunto_uno_PDB y terminando con un número.

El primer paso en el análisis es la identificación de las bases emparejadas obtenidas mediante la ejecución del programa find pair como antes, ya que todo el conjunto de estructuras comparte el mismo esquema de emparejamiento de bases, es necesario ejecutar find pair una vez sobre un archivo representativo aquí, el archivo que termina con 1001. Esto genera la información del emparejamiento de bases y la almacena en el archivo MD at set one BPS PS. El siguiente paso consiste en hallar los parámetros geométricos de todo el conjunto de estructuras utilizando el comando X 3D ncore ensemble.Analyze. Luego, los parámetros rígidos deseados pueden extraerse del archivo de salida general MD at set one out.

Esto se realiza utilizando el conjunto de extracción DCO tres del Command X. Se extraen los ángulos de alabeo y se crea un archivo de texto separado por comas con los ángulos de alabeo. Este archivo puede leerse en otros programas para análisis y representación gráfica adicionales.

La versión más reciente de 3D NA tiene una nueva característica que permite al usuario observar múltiples estructuras desde una perspectiva común. El comando reorientar del conjunto X tres DCO superpone una colección de estructuras relacionadas sobre un par de bases o un paso de pares de bases común, como en protocolos anteriores. El primer paso consiste en calcular el apareamiento de bases del ADN con el programa find pair.

En este caso, el archivo de entrada consiste en dos pdb KEK que contienen las 10 estructuras del operador CIA coli, O 3D NA unido a la región cabeza de la proteína represora LAC. El comando X tres DCO ensemble reorient alineará los modelos individuales de una estructura con múltiples modelos en un marco de referencia común. Este comando requiere como entrada tanto el archivo PDB como el archivo de apareamiento de bases del paso anterior.

También incluida en el comando está la identidad del paso de pares de bases frente al cual se alinean todas las estructuras. La interfaz web W 3D NA incluye algunas funciones populares del paquete de software 3D NA. Esta parte del video destaca la capacidad de construir modelos tridimensionales de ADN asociado a proteínas mediante el servidor web.

El primer paso para construir un modelo de ADN decorado con proteínas consiste en visitar el sitio web W 3D NA ubicado en W three d.rutgers.edu. La selección de reconstrucción en el menú situado en la esquina superior izquierda de la página activa las funciones de creación de modelos en línea. El siguiente paso es seleccionar el enlace de la plantilla de ADN con proteína unida, que se encuentra en el cuadro ligeramente sombreado en el centro de la nueva página.

Esta selección activará un menú desplegable que permite al usuario especificar el número de proteínas ligadas. La selección del número de proteínas ligadas conduce a una nueva página de especificaciones. A continuación, el usuario puede escribir o pegar la secuencia deseada.

En el cuadro de texto, en medio de la nueva página, hay un menú desplegable debajo del cuadro de texto para seleccionar la confirmación helicoidal de las regiones no ligadas del ADN. Hay un cuadro de texto cerca de la parte inferior de la página de especificaciones para ingresar las posiciones de unión y los nombres de archivo de las proteínas ligadas. La posición de unión especifica la ubicación del centro del fragmento de proteína ligada en la secuencia de ADN.

En la parte inferior de la página de especificaciones, hay un cuadro que permite al usuario generar una vista previa del ADN con proteína ligada. En este caso, se marca esa casilla y se hace clic en el botón continuar. Esta acción genera una página de revisión que enumera los parámetros seleccionados, así como cualquier error que pueda haber surgido por la superposición de los sitios de unión seleccionados.

El usuario puede seleccionar el botón de retroceso si es necesario realizar algún cambio, o el botón de construcción para continuar. La siguiente página muestra una imagen estática del complejo de ADN y proteína en su disposición más extendida y permite la visualización interactiva en línea a través de web. El usuario también puede descargar un archivo que contiene las coordenadas atómicas.

Las herramientas de software 3D NA se utilizan habitualmente para analizar estructuras de ácidos nucleicos. Los valores de los parámetros del cuerpo rígido revelan distorsiones en la estructura tridimensional, como los dos sitios de flexión extrema del ADN hacia el surco mayor con ángulos de rotación positivos grandes encontrados en los pasos 13 y 22. En el complejo cristalino de ADN con la proteína RHBB de Borrelia Bergdorf.

La capacidad del software para reconstruir estructuras a partir de estas cantidades permite determinar cómo contribuyen individualmente los pasos de bases y pares de bases al plegamiento molecular general. Como se ilustra aquí, la curvatura global del ADN inducida por HBB refleja algo más que las dos distorsiones extremas de rol mencionadas anteriormente. El ADN permanece altamente curvado cuando se reconstruye con estos pasos de pares de bases enderezados.

Esto ocurre cuando los dos valores más altos del rol se han establecido en cero. La nueva capacidad en 3D NA de examinar grandes cantidades de estructuras relacionadas permite extraer patrones dependientes tanto de la secuencia como del tiempo en las disposiciones espaciales de moléculas de ADN y ARN simuladas. Por ejemplo, el revestimiento de color amarillo de los ángulos de giro entre pares de bases sucesivos en dos grandes conjuntos de estructuras de ADN simuladas revela la flexión preferencial de estas moléculas en pasos de pares de bases de purina del Pérmico.

Los valores más altos de rotación representados en rojo que persisten durante breves períodos en los extremos del ADN sugieren una fusión localizada y un plegamiento nuevamente de la estructura de doble hélice. Los patrones variables de otros parámetros de cuerpo rígido, como los ángulos y distancias entre bases complementarias, pueden ayudar a descifrar las distorsiones estructurales precisas. La capacidad del software 3D NA para reorientar moléculas relacionadas en un marco de referencia común revela características de la estructura general ocultas en muchos de los archivos almacenados en la base de datos de proteínas.

Por ejemplo, el alineamiento convencional de estructuras relacionadas basado en un ajuste por raíz cuadrada media de los átomos correspondientes produce una serie de trayectorias espaciales similares que se superponen aproximadamente unas sobre otras; aquí, los 10 modelos basados en RMN del operador de ADN O 3D de Esia coli unido a las piezas cabezales de la proteína represora LAC. La superposición de las mismas estructuras sobre un marco de coordenadas común en el par de bases terminal cinco primos de cada dúplex revela distorsiones considerables de la estructura global, en las que las moléculas se flexionan en direcciones apreciablemente diferentes. La variabilidad estructural puede influir en la facilidad con la que la proteína represora LAC de CIA coli se une al O tres e induce un bucle entre el O tres y los operadores distantes secuencialmente en la operación LAC. Como se ilustra aquí, la colocación precisa de una proteína arquitectónica como HBB de Borrelia burgdorferi puede tener un efecto dramático sobre el plegamiento general del ADN.

Si dos copias de la estructura conocida de alta resolución están separadas por 43 pares de bases, un fragmento de ADN de 81 pares de bases se cierra en una configuración compacta, casi circular. Si las dos proteínas están separadas por cinco pares de bases adicionales, el ADN sigue una trayectoria abierta y sinuosa. Las configuraciones muy diferentes del dúplex decorado con proteínas muestran cómo el espaciado de las proteínas arquitectónicas puede afectar la ciclización o formación de bucles del ADN tras su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural de ácidos nucleicos exploraran las interacciones entre proteínas y ADN, el plegamiento del ARN y el diseño de nanopartículas, con el fin de obtener una mejor comprensión de los defectos del desarrollo y enfermedades como el cáncer, así como diseñar nuevas terapias.