La purificación y la agregación de la proteína precursora amiloide del dominio intracelular

El objetivo de este procedimiento es purificar el dominio intracelular del precursor de la proteína amiloide, también conocido como A ICD, y presentar un protocolo para la agregación térmica y caracterización del A ICD mediante microscopía de fuerza atómica. Esto se logra primero expresando una fusión A GST del A ICD en bacterias. A continuación, la proteína G-S-T-A-I-C-D se purifica, se escinde con trombina para separar la GST del A ICD y se elimina la GST.

Luego se induce la agregación térmica de A ICD. Finalmente, los agregados de A ICD se visualizan mediante microscopía de fuerza atómica. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran que A ICD puede purificarse hasta homogeneidad en cantidad suficiente para análisis bioquímicos y biofísicos.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, que requieren pasos complejos de cromatografía, es que se puede obtener un ICD altamente puro y soluble. Un ICD puede aislarse en la mesa de trabajo utilizando reactivos y equipos estándar. Un ICD producido mediante este protocolo es adecuado para caracterizaciones bioquímicas y biofísicas adicionales.

La procedura será demostrada por Amina ti. El Dr. Andres Oberer, ex becario postdoctoral de mi laboratorio, demostrará cómo realizar el análisis de microscopía de fuerza atómica de la A ICD. Para expresar el dominio intracelular recombinante de A PP, o A ICD, inicie con células BL 21 transformadas con el vector pgx 41, que porta la A ICD humana fusionada al extremo C del GST. Inocule con una colonia única 10 mililitros de caldo LB con ampicilina e incube durante la noche a 37 grados Celsius con agitación vigorosa. A la mañana siguiente.

Incubar 400 mililitros de LB con ampicilina en un matraz de un litro con cinco mililitros de la cultura nocturna. Incubar a 37 grados Celsius con agitación vigorosa hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance entre 0,4 y 0,6. Esto normalmente tomará de dos a 2,5 horas para inducir la expresión de G-S-T-A-I-C-D.

Agregamos 0,4 milimolar de IPTG e incubamos a 37 grados Celsius con agitación vigorosa durante cinco horas. Centrifugamos las células a 6.000 × g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius y almacenamos el precipitado a menos 80 grados Celsius. Después de preparar el tampón de lisis y colocar las bacterias en hielo, agregamos 20 mililitros de tampón al precipitado y, mediante una combinación de vortex y pipeteo en hielo, homogeneizamos completamente.

Reese suspenda el pellet bacteriano y pase el lisado bacteriano suspendido mediante un emulsionador previamente enfriado o una prensa de Francia. A 30.000 PSI, pase el lisado a través del emulsionador por segunda vez y recójalo en un tubo de 50 mililitros previamente enfriado. Centrifugue el lisado a 15.000 × g y 4 °C durante 30 minutos.

Separar y transferir el sobrenadante a un tubo de 50 mililitros previamente enfriado. Añadir 500 microlitros de una suspensión al 50 % de glutatión inmovilizado. Rotar durante 30 minutos a cuatro grados Celsius mientras la muestra está en rotación.

Prepare un tampón de elución fresco después de la incubación. Vierta el lisado y la suspensión en una columna cromatográfica desechable de poliestireno de cinco pulgadas con filtros gruesos. Lave la columna cinco veces con tres mililitros de PBS.

Tape la parte inferior de la columna y agregue 500 microlitros de tampón de elución a temperatura ambiente. Tape la parte superior de la columna y rote durante cinco minutos a temperatura ambiente. Recopile el eluido inicial en un tubo microfugado de 1,5 mililitros enfriado.

Repita la elución otras dos veces. Dialese el eluato en una membrana de diálisis con un límite de exclusión de peso molecular de 10,000 en cuatro litros de PBS durante la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente. Dialese frente a cuatro litros adicionales de PBS a cuatro grados Celsius durante una hora.

Retire el proteína del cassette de diálisis y realice un ensayo de cuantificación proteica para determinar el rendimiento de G-S-T-A-I-C-D. Una purificación típica a partir de 400 mililitros de cultivo dará como resultado rendimientos superiores a 20 miligramos de proteína purificada, con concentraciones de 10 a 20 miligramos por mililitro. Aliquote la proteína en alícuotas de 200 microlitros y congele a menos 80 grados Celsius.

Para liberar el A ICD del GST descongelado, tome 200 microlitros de G-S-T-A-I-C-D purificado y añada 20 microlitros de trombina de una unidad por microlitro, incube toda la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, elimine cualquier material agregado mediante centrifugación a 20.000 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a un tubo micro ya enfriado para eliminar el GST y la trombina. Añada 50 microlitros de una suspensión al 50 % de glutatión agarosa y 50 microlitros de una suspensión al 50 % de fenil-agarosa, respectivamente.

Incubar con rotación durante cinco minutos a temperatura ambiente. Centrifugar brevemente para sedimentar las perlas de agro y eliminar el sobrenadante en un tubo nuevo. Extraer la GST cuatro veces más con glutatión.

Aros realiza un ensayo de cuantificación proteica en cinco microlitros del A ICD purificado. Los rendimientos típicos obtenidos a partir de un cultivo de 400 mililitros oscilan entre 50 y 100 microgramos, con una concentración de 0,2 a 0,5 miligramos por mililitro. Tras diluir el A ICD recién preparado en PBS hasta una concentración de 0,1 miligramo por mililitro, se indujo la agregación térmica incubando las muestras a 43 grados Celsius durante 48 horas en un agitador térmico a 800 RPM.

Diluya la muestra 20 veces con agua desionizada y aplique dos microlitros sobre mica recién dividida. Seque la muestra en un desecador durante la noche para visualizar el A ICD agregado mediante microscopía de fuerza atómica en modo tapping, utilizando microbalanzas de nitruro de silicio recubiertas de oro con un radio de punta nominal de dos nanómetros.

Amplitudes típicas de golpeteo durante la imagen, de 10 a 20 nanómetros a la frecuencia de resonancia de los cantilever. Aquí se muestra la expresión y el enriquecimiento relativo de G-S-T-A-I-C-D. Tras la lisis, la mayor parte de la proteína de fusión se encuentra en la fracción soluble, por lo que no es necesario su extracción a partir de cuerpos de inclusión.

El material eluido de la columna de glutatión está mayor al 95 % de pureza. En la preparación mostrada aquí, la concentración de proteína eluida de la columna fue de 14,5 miligramos por mililitro, y el rendimiento fue de 22 miligramos. La escisión de 200 microlitros de esta preparación durante la noche con 20 unidades de trombina resultó en casi un 100 % de escisión de la proteína de fusión.

La cantidad de trombina utilizada es lo suficientemente baja como para no ser detectable mediante kumasi. La tinción azul y la eliminación de la trombina y la GST provocaron cierta pérdida de material. Sin embargo, la pureza fue superior al 90 %, con un rendimiento en esta preparación de 70 microgramos de A ICD a una concentración de 0,35 miligramos por mililitro.

Las agregaciones de AICD, visualizadas mediante microscopía de fluorescencia (FM), son típicamente amorfas esteroideas y tienen un tamaño que oscila entre 50 y 100 nanómetros. El material agregado no es detectable cuando se añade una cantidad equimolar de la chaperona UBI Quillin uno a la reacción de agregación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo purificar EICD, inducir su agregación y visualizar los agregados mediante A-F-M-E-I-C-D.

La proteína purificada mediante esta técnica puede aplicarse a otros métodos, como ensayos de dispersión de luz y retención en filtros, para responder preguntas sobre el efecto de las chaperonas moleculares en la agregación de EACD.