Alto rendimiento secuencial ELISA para la Validación de Biomarcadores de aguda injerto contra huésped

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar el método secuencial Eliza de alto rendimiento para analizar de manera eficiente un gran número de biomarcadores novedosos descubiertos mediante proteómica. Esto se logra primero agregando muestras a una placa fuente, que se utiliza para crear la dilución de cada biomarcador y para almacenar el plasma recuperado entre pruebas. A continuación, se realizan ensayos Eliza para cada proteína con el fin de determinar sus concentraciones en las muestras de los pacientes.

Finalmente, se puede evaluar el aumento de los niveles proteicos de estos biomarcadores al inicio de las manifestaciones clínicas de la enfermedad del injerto contra el huésped aguda. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que los analizadores secuenciales pueden analizar múltiples proteínas novedosas que no siempre están disponibles en plataformas de multiplexación elevada. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de la enfermedad del injerto contra el huésped aguda.

Dado que ahora se están investigando biomarcadores validados mediante este método para la atención clínica. Aunque este método puede proporcionar información sobre complicaciones en el trasplante de células madre poéticas pos traumatismo. También puede aplicarse al descubrimiento y validación de biomarcadores para otras enfermedades, como el trasplante de pulmón, complicaciones, cáncer de pulmón, o potencialmente cualquier enfermedad para la cual una prueba sanguínea diagnóstica sea útil.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que es importante que los múltiples pasos se realicen de manera consistente para garantizar la reproducibilidad y una baja variabilidad entre lotes. El día anterior al experimento, centrifugue las muestras de alícuotas de plasma durante 10 minutos a 15.300 RCF y cuatro grados Celsius para separar los coágulos en la parte inferior y los lípidos en la parte superior del plasma. Luego, plaque 150 microlitros de plasma sin diluir de cada muestra en una placa de fondo en V de 96 pocillos mediante pipeteo manual según mapas predeterminados. Envuelva la placa en Parafilm y colóquela en una cámara humedecida a cuatro grados Celsius durante un máximo de 72 horas.

A continuación, tras reconstituir y diluir el receptor alfa de la IL-2 y el factor de crecimiento hepatocito, o anticuerpos capturadores de HGF, según las especificaciones del fabricante, agregue alícuotas de 50 microlitros de cada anticuerpo en cada pocillo de placas de 96 pocillos de unión alta, tipo medio pocillo, respectivas. Luego selle estas placas con un sellador de placas e incúbelas durante la noche a cuatro grados Celsius. Ahora diluya reg tres alfa con el tampón de recubrimiento del fabricante según el protocolo del fabricante y agregue 25 microlitros de la solución en cada pocillo de una placa de 384 pocillos sin maxor.

Luego, almacene esta placa sellada a cuatro grados Celsius también durante el primer día del experimento. Comience lavando la placa de prueba del receptor alfa IL-2 y bloquéela con blotto en TBS. Después de reconstituir el estándar, prepare una curva estándar de ocho puntos según el protocolo del fabricante.

Coloque a continuación 50 microlitros de plasma sin diluir y 50 microlitros de cada estándar en duplicado desde la placa fuente hasta la placa de prueba de ELIZA. Luego, incube la placa sellada a temperatura ambiente en un rotador de placas ajustado a 300 RPM. Después de dos horas, recupere el plasma de la placa de prueba de ELIZA del receptor alfa de IL-2 y devuélvalo a la placa fuente de plasma sin diluir.

Luego de completar la EIA según el protocolo del fabricante, lea la densidad óptica de cada pocillo utilizando un lector de placas ajustado a 450-570 nanómetros para el ensayo Eliza de tres alfa rico. Primero transfiera 10 microlitros de plasma sin diluir a una placa fuente separada con fondo transparente, y luego agregue 90 microlitros del tampón de dilución proporcionado por el fabricante a cada pocillo para crear una placa fuente con una dilución 1:10. Después de completar el ensayo Eliza de Reg tres alfa, según el protocolo del fabricante, agregue la solución de parada a la placa de 384 pocillos y lea la densidad óptica de cada pocillo utilizando un lector de placas ajustado a 450-620 nanómetros. Tras la reconstrucción y dilución de los anticuerpos de captura de elefante y tn FFR uno según las especificaciones del fabricante, codifique cada pocillo de las respectivas placas de 96 pocillos de unión alta y media altura con 50 microlitros de los anticuerpos de captura.

Luego, incubar las placas de prueba selladas durante la noche a temperatura ambiente para la placa de elefante y a cuatro grados Celsius para la placa TN FFR. Después de completar la transferencia del receptor alfa de IL dos mediante Eliza, transferir 60 microlitros de plasma sin diluir a una nueva placa fuente. A continuación, añadir 60 microlitros de BSA al 1% en PBS a cada pocillo para obtener una placa fuente de plasma diluida uno a dos.

A continuación, lave y bloquee la placa de prueba de HGF con BLOTTO en TBS y prepare la curva de dilución estándar de ocho puntos. Después de lavar la placa, tras el paso de bloqueo, agregue alícuotas duplicadas de 50 microlitros de plasma diluido uno a dos y de cada estándar en la placa de prueba EISA. Incube entonces la placa sellada durante la noche a temperatura ambiente en un rotador de placas ajustado a 300 RPM.

Al día siguiente, recupere el plasma diluido uno a dos de la placa del ensayo HGF Eliza y colóquelo nuevamente en la placa fuente de plasma diluido uno a dos. Después de completar el EIA, según el protocolo del fabricante, lea la densidad óptica de cada pocillo utilizando un lector de placas ajustado a entre 450 y 570 nanómetros, el segundo día del experimento. Primero transfiera 10 microlitros de plasma sin diluir a una nueva placa fuente y luego añada 190 microlitros de BSA al 1% en PBS para obtener 200 microlitros de plasma diluido uno a 20.

Luego de completar el ensayo de elefante, Eliza leyó la densidad óptica utilizando un lector de placas ajustado a 450-570 nanómetros, según el protocolo del fabricante. Para el TN FFR uno, Eliza agregó primero 25 microlitros de BSA al 1 % en PBS a la placa fuente de uno a 20, obteniendo 125 microlitros de plasma diluido uno a 25 por pocillo. Luego de completar el EIA de TN FFR uno según el protocolo del fabricante, leyó la densidad óptica de cada pocillo utilizando un lector de placas ajustado a 450-570 nanómetros; para la transferencia inicial de I-L-H-E-I-A, transfirió 60 microlitros de plasma diluido uno a dos a una nueva placa fuente y luego agregó 180 microlitros de diluyente de IL-8 a cada pocillo para obtener una placa fuente de plasma diluido uno a seis.

Luego de completar la ELISA siguiendo el protocolo del fabricante, lea la densidad óptica de cada pocillo utilizando un lector de placas ajustado a 450-570 nanómetros. Finalmente, una vez que se hayan completado todas las ELISA, devuelva el plasma sobrante al tubo Eloqua y congélelo para su uso futuro. En este gráfico, se muestran las densidades ópticas de la curva patrón de siete placas ELISA diferentes que miden las concentraciones de reg tres alfa correspondientes a los 1084 pacientes analizados en el informe inicial del biomarcador de enfermedad del injerto contra el huésped gastrointestinal por reg tres alfa. Las densidades ópticas consistentes entre las placas aseguran mediciones consistentes de la concentración de proteína entre experimentos.

Las concentraciones de las proteínas en las muestras de plasma se calcularon comparando las densidades ópticas de las muestras con las densidades ópticas de la curva patrón. Se puede utilizar una plataforma robótica de manipulación estéril para aumentar aún más la reproducibilidad y, al mismo tiempo, reducir el volumen de plasma utilizado al realizar ELISA en placas de pozo de formato creativo. Al planificar este procedimiento, es importante realizar primero los EIS con plasma sin diluir, para que pueda recuperarse y utilizarse en experimentos posteriores tras su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la proteómica exploraran biomarcadores candidatos en cualquier enfermedad de interés mediante el uso universal de Eliza secuenciales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo validar múltiples biomarcadores utilizando E secuenciales, empleando volúmenes pequeños de plasma y minimizando los ciclos libres.