Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad de los canales de potasio KV siete en células de músculo liso arterial mesentérico disociadas recientemente, y relacionar esto con las mediciones del diámetro arterial registradas bajo condiciones fisiológicas. Esto se logra primero mediante la extracción quirúrgica del arco vascular mesentérico de una rata. El segundo paso consiste en diseccionar y limpiar los segmentos de las arterias mesentéricas.

A continuación, algunos segmentos se utilizan para aislar células individuales del músculo liso con el fin de realizar mediciones electrofisiológicas mediante parche de corrientes de potasio KV siete. El último paso consiste en la canulación de segmentos arteriales intactos para medir mediante miografía a presión la constricción o dilatación arterial en respuesta a moduladores farmacológicos de los canales de potasio KV siete. En definitiva, la combinación de electrofisiología mediante parche y miografía a presión se utiliza para demostrar cómo un aumento o una disminución en la actividad de los canales de potasio KV siete afecta la constricción arterial mesentérica.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el uso de canales clonados expresados en líneas celulares, es que las corrientes se registran a partir de células no cultivadas que expresan naturalmente los canales, y las corrientes KV pueden aislarse de otras clases de canales de potasio que podrían activarse en las mismas células. La micromiografía por presión permite registrar las respuestas funcionales del mismo tejido del cual se obtienen las células aisladas, y el método es tanto más sensible como más fisiológico que otras preparaciones, como anillos arteriales o tiras arteriales. El Dr. Bareth Mani, investigador posdoctoral de mi laboratorio, demostrará las técnicas de canulación arterial y micromiografía por presión, y la Dra. Luba Brueggeman, profesora asistente de investigación en mi laboratorio, demostrará los procedimientos de aislamiento celular y de parche plano.

Para comenzar este procedimiento, use un par de tijeras quirúrgicas para cortar un segmento de 10 a 12 centímetros en ambos extremos del intestino delgado de una rata. Luego, aísle el intestino junto con su vasculatura asociada. A continuación, sujete el segmento de intestino delgado.

Extienda el mesenterio sobre el lado cercano de la cámara de manera que la rama principal de la arteria mesentérica superior quede en el centro y las ramas subsiguientes irradien desde el centro. Luego coloque las agujas solo en los segmentos intestinales visualizando a través de un microscopio estereoscópico iluminado. Retire cuidadosamente el tejido adiposo y el tejido conectivo que rodea las arterias de segundo a cuarto orden cercanas a los intestinos, utilizando pinzas microquirúrgicas y tijeras.

Sujete las venas adyacentes para facilitar la eliminación del tejido adiposo y del tejido conectivo y evitar el estiramiento innecesario de las arterias. A continuación, transfiera dos o tres segmentos de la arteria mesentérica a una placa de cultivo tisular de 35 milímetros que contenga dos mililitros de solución de aislamiento fría con hielo. Coloque la placa sobre hielo posteriormente y corte los segmentos de la arteria mesentérica en trozos de tres a cuatro milímetros de longitud utilizando una pipeta con la punta pulida al fuego.

Transfiera los segmentos arteriales a un vial de vidrio que contenga dos mililitros de solución de aislamiento precalentada a 37 grados Celsius. A continuación, incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Después de 30 minutos, aspire cuidadosamente la solución de aislamiento a 37 grados Celsius con una pipeta posterior.

Agregue dos mililitros de solución enzimática tibia, luego incube durante 35 minutos a 37 grados Celsius. Inmediatamente después de la incubación de 35 minutos en la solución enzimática, coloque el vial en hielo, aspire la solución enzimática y agregue dos mililitros de solución de aislamiento fría con hielo. Repita este procedimiento cuatro veces.

Luego, en un mililitro de solución de aislamiento fría con hielo, itere suavemente los segmentos arteriales con la pipeta posterior pulida de 10 a 20 veces para liberar células individuales del músculo liso de la arteria mesentérica. Verifique periódicamente el aspecto de los miocitos colocando una gota de la suspensión celular en una placa de 35 milímetros y observándolos bajo el microscopio.

Las CML de MA sanas deben tener un aspecto alargado y liso. A continuación, transfiera aproximadamente de 100 a 200 microlitros de la suspensión celular a la cámara de registro con una pipeta Pasteur pulida y permita que las células se adhieran durante 15 minutos. En este paso, llene la punta de la pipeta de registro con amfotericina B, sumergiendo la punta de la pipeta en la solución interna libre.

Luego, aplique succión en el otro extremo utilizando una jeringa de 10 mililitros conectada mediante un trozo de tubo, agregue información al pipeteado que contiene la solución desde la parte superior. Utilice una punta de pipeta micro cargadora einor hasta que la pipeta se llene aproximadamente hasta la mitad con la solución. Elimine cualquier burbuja de aire golpeando suavemente la pipeta.

A continuación, inserte la pipeta en el porta-electrodos. Utilice un micromanipulador para bajar la pipeta hasta la superficie de un miocito alargado. Cuando la resistencia de la pipeta aumente a entre seis y diez megaohmios, aplique succión para lograr un sello en el rango de gigaohmios.

Al mismo tiempo, ajuste el voltaje de retención a cero milivoltios mientras espera la perforación de la membrana. A continuación, aplique pasos de voltaje de 100 milisegundos a más 10 milivoltios y luego a menos 10 milivoltios. Utilice el amplificador para compensar el transitorio de capacitancia rápida de la pipeta concurrente con la aparición de la capacitancia de toda la célula.

Corrientes positivas transitorias pequeñas y sostenidas de dos a 10 picoamperios, puras y de amplitud, indican la presencia de canales KV siete funcionales. La perforación exitosa con anfotericina B reducirá la resistencia de acceso a 35 megaohmios o menos. Para registrar la relación corriente-voltaje del canal KV siete, aplique escalones de voltaje de cinco segundos a voltajes que varían desde menos 84 milivoltios, en los cuales la probabilidad de apertura de los canales KV siete es mínima, hasta más 16 milivoltios, en los cuales la probabilidad de apertura de los canales KV siete alcanza una meseta. Después de cinco segundos en cada voltaje de prueba, regrese al voltaje de mantenimiento de menos cuatro milivoltios durante 10 segundos.

En este procedimiento, suspenda ligeramente dos suturas finas de nailon previamente preparadas en cada lado. Junto a la cánula de vidrio, transfiera cuidadosamente el segmento de arteria mesentérica diseccionado desde la cámara de disección hasta la cámara de miografía a presión, sosteniendo un extremo del segmento con un par de pinzas microquirúrgicas. A continuación, visualizando a través de un microscopio estereoscópico iluminado, sostenga un extremo del segmento arterial y deslícelo suavemente sobre la cánula de vidrio izquierda.

Asegure el extremo utilizando los puntos de sutura de nailon. Luego, enjuague suavemente el fluido del lumen a través del vaso montado para eliminar la sangre y los restos. A continuación, cierre la válvula hacia la jeringa izquierda para que este lado presente una columna estática de fluido contra la cual se ajusta la presión desde el lado derecho; utilice el micromanipulador para posicionar la cánula de vidrio móvil derecha más cerca del segmento arterial y deslice el extremo derecho del segmento sobre ella.

Finalmente, asegure el segmento arterial con suturas de nylon y corte los extremos excedentes de los hilos de sutura. Ahora monte la unidad del gráfico de presión sobre la platina, encima del microscopio de micrografía de presión. Conecte la columna de presión al lado derecho de la cámara del gráfico y luego coloque la tapa sobre la cámara.

Eleve gradualmente la jeringa de 10 mililitros durante un período de 15 minutos y verifique si hay fugas en el vaso hasta que el transductor de presión P uno marque 80 milímetros de mercurio; ajuste la distancia entre la cánula cuando sea necesario, de manera que el segmento arterial presurizado quede aproximadamente recto y forme un patrón en forma de hombro en los puntos donde se hacen los lazos. Verifique la viabilidad del vaso montado mediante la superfusión transitoria con cloruro de potasio 60 milimolar durante 30 segundos. Un vaso viable se contrae rápidamente con la adición de cloruro de potasio y se dilata inmediatamente tras su lavado.

A continuación, agregue la sustancia de prueba concentrada directamente a la solución del baño, pipeteándola suavemente de ida y vuelta cerca del extremo de la cámara para mezclar la sustancia de prueba en la solución del baño, obteniendo así la concentración final adecuada en la cámara de 10 mililitros. Los cambios de volumen en el diámetro del vaso tras la adición de la sustancia de prueba pueden monitorearse en la imagen de video en vivo y también registrarse en la ventana de análisis de imágenes mientras el experimento está en curso. Esta figura muestra una serie de trazos de corriente secuenciales registrados en respuesta a escalones de voltaje antes del tratamiento, mostrados en negro, y tras la estabilización en presencia de 100 nanomolares de zinc perion en un único miocito de arteria mesentérica, mostrados en rojo; aquí se presentan las corrientes representativas para el control y para 100 nanomolares de zinc perion.

Las barras grises indican el intervalo de tiempo en el que se midieron las amplitudes medias de la corriente. En las gráficas de corriente-voltaje, los voltajes escalonados se indican a la derecha mediante puntas de flecha. Este es el curso temporal del aumento de la corriente KV siete inducido por 100 nanomolar de ion zinc, medido mediante un clamp de voltaje continuo a −20 milivoltios. Se muestran aquí las curvas promedio de corriente-voltaje derivadas de las densidades de corriente KV siete registradas antes y durante el tratamiento con 100 nanomolar de ion zinc, y durante el tratamiento con 10 micromolar del bloqueador del canal KV siete XC 991. Relajación inducida por iones de zinc en la arteria mesentérica previamente contraída con 100 picomolar de arginina vasopresina.

Esta figura muestra el curso temporal de los cambios en el diámetro externo del vaso en respuesta a la aplicación de 100 picomolares de arginina vasopresina, seguida por la aplicación de 100 nanomolares de ion zinc. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar arterias para el aislamiento de células individuales o para la medición miográfica bajo presión de la constricción arterial y las respuestas dilatadoras. Además, debería saber cómo registrar las corrientes KV siete aisladamente de otras corrientes en miocitos arteriales recién aislados.