Visualización de las bacterias en los nematodos mediante microscopía de fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es observar simbiontes bacterianos marcados con fluorescencia dentro de su hospedador nematodo. Esto se logra primero marcando las bacterias con una proteína fluorescente mediante conjugación. El segundo paso consiste en aislar nematodos AIC mediante la recolección de huevos.

A continuación, los nematodos AIC se cultivan en combinación con su simbionte bacteriano marcado con fluorescencia para permitir la asociación natural y, en última instancia, la localización del simbionte bacteriano dentro del hospedador nematodo. La frecuencia de esta asociación dentro de la población de nematodos puede determinarse mediante microscopía de fluorescencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la simbiosis, como ¿dónde se localizan las bacterias dentro de su hospedador? y ¿cuál es la distribución del transporte bacteriano a través de una población de hospedadores?

Después del crecimiento nocturno de las cepas bacterianas, realice un subcultivo de las cepas donadora, receptora y auxiliar en un medio de crecimiento rico en nutrientes sin antibióticos, en una proporción de uno a 100 de cultivo respecto al medio, y luego cultive las muestras a la temperatura adecuada para cada cepa hasta que alcancen la fase logarítmica media. A continuación, combine las cepas en un único tubo de microcentrífuga y centrifugue los cultivos mezclados durante dos minutos a 17.900 ×g, deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 30 microlitros de medio fresco. Luego, coloque la suspensión en una placa de medio rico en nutrientes sin antibióticos y deje que la gota se seque; cuando la suspensión esté seca, continúe con el siguiente paso.

Incube la placa invertida durante la noche a una temperatura óptima para la bacteria receptora y permisible para el donador y el auxiliar, si corresponde. Ahora, raspe el punto y estríe para obtener colonias aisladas en una placa con antibiótico selectivo, con el fin de obtener un cultivo puro de bacterias, es decir, una colonia individual para aislamiento. Finalmente, asegúrese de que las colonias resultantes sean el simbionte receptor y no la cepa donadora.

Mediante el cribado de la presencia de fenotipos específicos del receptor. Por ejemplo, las bacterias cino abdi pueden distinguirse de E. coli realizando una prueba de catalasa, cribando la presencia del plásmido mediante la confirmación de fluorescencia bajo la longitud de onda correspondiente a la proteína fluorescente del plásmido. Después de cultivar la bacteria simbionte natural durante la noche, distribuya 600 microlitros de la cultura bacteriana sobre ocho a diez discos de agar de 10 milímetros, y luego incube las placas en la oscuridad y sin humedad a 25 grados Celsius.

Después de dos días, agregue 5.000 nematodos juveniles infecciosos en 500 microlitros de medio a las colonias bacterianas. Después de incubar las placas a 25 grados Celsius durante tres días más, coloque 20 microlitros de agua sobre un portaobjetos de microscopio. Luego, utilice un asa estéril para raspar una pequeña cantidad de nematodos de la colonia bacteriana.

Coloque el trozo en el agua para permitir que los nematodos naden fuera. Observe esta preparación con baja ampliación. Si se observan huevos y hembras, continúe cuando las hembras contengan huevos; coloque unos pocos mililitros de agua sobre la superficie de las placas, agite suavemente las placas y luego vierta el agua en un tubo cónico de 50 mililitros.

Los nematodos deben desprenderse de las placas y ya no ser visibles en la superficie de la placa. Deje que los nematodos sedimenten en el fondo del tubo, luego aspire el exceso de agua desde la parte superior del tubo y rellene el tubo con agua limpia. Después de permitir que los nematodos adultos sedimenten y aspirar el exceso de agua una vez más, llene los tubos cónicos con la solución de huevos.

Luego, mezcle los tubos mediante inversión suave durante exactamente 10 minutos a temperatura ambiente. Después de agitar, centrifugue inmediatamente los tubos cónicos durante exactamente 10 minutos a 1.250 Gs y temperatura ambiente con el freno activado. Luego, deseche rápidamente el sobrenadante, re suspenda el sedimento con la solución de huevo mediante pipeteo y llene el tubo cónico con solución de huevo fresca.

Mezcle bien la suspensión de huevos invirtiendo el tubo de tres a cinco veces y luego, inmediatamente después, centrifugue los huevos y deseche el sobrenadante como se acaba de mostrar. Reuspenda el sedimento en caldo misogino, caldo o LB mediante pipeteo, y luego transfiera la suspensión de huevos a un tubo cónico de 15 mililitros. Ahora llene el tubo de 15 mililitros con LB, lave los huevos tres veces en el caldo utilizando la misma técnica rápida que acaba de demostrarse, y luego diluya los huevos de P nematodo resuspendidos hasta al menos 10 huevos por microlitro.

Transfiera los huevos a una placa de Petri de seis centímetros que contenga cinco mililitros de LB y antibióticos contra bacterias colonizadoras. La placa puede almacenarse envuelta en perfil hasta cuatro días después del crecimiento nocturno y la selección de las bacterias fluorescentes. Utilice un asa estéril para distribuir 600 microlitros de la cultura bacteriana sobre aerates lipídicos de 10 milímetros y para incubar la cultura a 25 grados Celsius.

Después de dos días, distribuya de 500 a 5.000 huevos de nematodos sobre cada placa de lípidos. Si la placa ha sido almacenada, lave los huevos con 15 mililitros de LB, como se acaba de demostrar, al menos una vez antes de inocular los huevos sobre los céspedes bacterianos previamente preparados. A continuación, incube los cultivos mixtos de nematodos y bacterias en la oscuridad y sin humedad a 25 grados Celsius hasta que aparezcan estadios juveniles infecciosos como un anillo blanco borroso en el borde de la placa.

Cuando se hayan observado los juveniles infectivos, retire la tapa de la placa de agar con lípidos y coloque el fondo de la placa dentro del fondo de una placa de Petri vacía de 100 milímetros por 20 milímetros. Luego, llene la placa de Petri con suficiente agua como para alcanzar aproximadamente la mitad de la altura de la placa más pequeña e incube la trampa de agua hasta que los juveniles infectivos descendientes hayan emergido en el agua.

Después de recolectar los nematodos del agua o del estadio de vida deseado a partir del césped bacteriano apropiado, disuelva unos pocos granos de ole en 30 microlitros de agua y agregue uno o dos microlitros de este agente paralizante por cada 50 microlitros de muestra de nematodos. Luego, transfiera aproximadamente de 20 a 30 microlitros de la muestra de nematodos paralizados a un portaobjetos para microscopio y coloque una cubeta encima de la muestra. Observe los nematodos mediante microscopía de luz para asegurarse de que los nematodos estén en el campo de visión.

Para identificar la localización bacteriana. Fotografíe los nematodos mediante microscopía de fluorescencia además del ajuste de microscopía de luz, y luego superponga las imágenes. Puede ser necesario probar varias ampliaciones y vistas del nematodo para encontrar las bacterias.

Se contó y evaluó una población de nematodos procedente de dos medios para determinar la colonización por el simbionte bacteriano. Para obtener estadísticas robustas, es recomendable contar al menos 100 nematodos por muestra, con al menos 30 en cada categoría, tal como se muestra en la tabla. Estos nematodos presentan un nivel de colonización de aproximadamente 14,6 % cuando se cultivan en agar lipídico y de 68,6 % cuando se cultivan en agar de hígado y riñón.

Se ha demostrado que otras especies de nematodos y bacterias presentan diferentes niveles de colonización. Este esquema ilustra la apariencia general de las hembras de Steiner NEMA. El recuadro muestra la imagen de contraste de interferencia diferencial de una hembra S fot gráfica a 20 x de aumento.

La flecha negra en el recuadro indica la vulva, mientras que las flechas blancas indican huevos visibles. Esta imagen muestra un huevo desarrollado pero no eclosionado del nematodo volt a 40 x de magnificación, y estos huevos aislados de nematodos Volta se capturaron con 10 x de magnificación. Aquí se muestran imágenes representativas al microscopio de nematodos Steiner Nima asociados con bacterias Xeno aptus en esta primera imagen.

Los nematodos de Alvin estaban asociados con su simbionte bacteriano expo que expresa GFP para crear esta imagen compuesta. Se superpuso una imagen de contraste de fase con una imagen fluorescente. La flecha indica las bacterias presentes dentro del nematodo juvenil infeccioso.

Esta imagen muestra un nematodo juvenil de S carpa capsi con la bacteria X nla expresando GFP. La imagen fue construida de manera similar a la imagen anterior y representa al nematodo juvenil con bacterias marcadas con proteína verde fluorescente, visualizadas como barras verdes localizadas a lo largo del lumen intestinal del nematodo. Además del procedimiento descrito, se pueden incorporar otros métodos, como la manipulación genética del simbionte bacteriano antes de su asociación con el hospedador nematodo, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como cuáles son los mecanismos moleculares necesarios para la asociación entre el hospedador y el microbio.