Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar el sueño y la función inmunitaria en drosófila. Primero, esto se logra registrando la actividad locomotora de moscas infectadas para medir el sueño y la supervivencia; en un segundo paso, tras la infección, las moscas se homogenizan, diluyen y siembran en placas de agar LB. El número de unidades formadoras de colonias que crecen indica la capacidad de las moscas para eliminar la infección.

A continuación, se añaden moscas infectadas que expresan un transgén que contiene el reportero de luciferasa NF kappa b a una placa de 96 pocillos que contiene luciferina, el sustrato de la luciferasa. La medición en tiempo real de la luciferasa kappa b indica la activación de una vía de señalización NF kappa B durante la infección, junto con el resultado de supervivencia y sueño. La eliminación bacteriana y la actividad del reportero NF KB son mediciones que proporcionan una perspectiva mecanicista sobre el vínculo molecular entre la función inmunitaria y el comportamiento.

Generalmente, las personas nuevas en este método tienen dificultades porque se requiere tiempo y práctica para aprender a infectar manualmente las moscas de forma consistente. La principal ventaja de la técnica del reportero luciferasa frente a métodos existentes como la QPCR es que la actividad de NF-kappa B se puede medir continuamente en tiempo real en moscas vivas. Comience incubando cultivos de Drosophila en etapa de pupa tardía durante tres a cuatro días, para que los adultos se adapten a las condiciones ambientales.

Aquí, las moscas se colocan bajo luz constante para eliminar la influencia del reloj circadiano en la respuesta inmunitaria y el comportamiento. A continuación, cargue de uno a cuatro días de moscas en la actividad. Los monitores registran su actividad durante un mínimo de tres días antes de la infección, un día antes de la infección programada.

Seleccione una única colonia de SIA con la punta estéril de una pipeta y sumerja la punta en un tubo de cultivo que contenga cinco mililitros de medio LB para verificar la técnica estéril. No olvide preparar un cultivo control simulado sin bacterias. Incube las bacterias durante la noche hasta que alcancen la fase de crecimiento exponencial al día siguiente.

Mida la absorbancia del cultivo a 600 nanómetros. Incluya un segundo Q vet como blanco. Está listo cuando la concentración esté entre 0,5 y una unidad de absorbancia subcultivo, o prolongue el tiempo de cultivo según sea necesario.

Ahora prepare la solución bacteriana para infectar a las moscas. Diluya las bacterias con PBS hasta una absorbancia esperada de 0.1 a 600 nanómetros. Luego agregue colorante alimentario como control de inyección.

Sustituya las bacterias por medio LB. Almacene ambas soluciones en hielo. A continuación, utilizando un tirador de micropipetas, fabrique agujas de inyección con una punta fina bajo un microscopio estereoscópico.

Utilice pinzas finas para quebrar la punta de cada aguja de modo que la abertura sea lo suficientemente grande como para llenarla con el líquido de inyección mediante succión, pero lo suficientemente pequeña para minimizar el daño a la mosca. Sujete una aguja de vidrio a una jeringa plástica de tres cc con un tramo de tubo utilizando la jeringa. El flujo del medio de inyección se controla manualmente.

Evite contaminar el tubo de goma con el líquido de inyección, ya que el aparato de jeringa se utiliza tanto para inyecciones infecciosas como para inyecciones control. Verifique el flujo del medio de inyección utilizando un tejido de limpieza Kim. Dos aspectos fundamentales para lograr inyecciones exitosas son el uso del tamaño óptimo de aguja y el sello seguro entre la aguja y la jeringa.

Una vez que el sistema de inyección esté completamente preparado, anestesie las moscas utilizando un flujo mínimo de dióxido de carbono; proceda rápidamente para que ninguna mosca permanezca anestesiada durante más de cinco minutos. Ahora inyecte las moscas introduciendo la aguja de vidrio en la región situada por encima del escutelo del tórax dorsal. La entrada del medio de inyección en la mosca se verifica mediante el colorante alimentario, que puede observarse cuando la solución inyectada se extiende.

Antes de comenzar, asegúrese de que todos los materiales utilizados para este procedimiento hayan sido autoclavados al menos un día de antelación. Prepare placas de Petri de 10 centímetros con medio de agar LV. El día del experimento, anestesie y coloque las moscas en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros.

Prepare un mínimo de dos grupos de 10 moscas cada uno por condición experimental. También prepare un grupo control de moscas sin infección, especialmente cuando utilice una cepa bacteriana sin resistencia a antibióticos. Almacene todos los tubos cargados sobre hielo.

A continuación, agregue 400 microlitros de medio LB a cada tubo cargado con moscas. Homogenice las moscas utilizando un pequeño pistilo y hágalo cerca de una llama para prevenir contaminación. Ahora, utilizando puntas de pipeta cortadas, realice diluciones seriadas del homogenato en factores de 10 en volúmenes de 200 microlitros.

Si el homogenato se prepara inmediatamente después de la infección con sia, realice diluciones hasta uno a 1000, pero para el homogenato a las 24 horas posteriores a la infección, haga diluciones hasta uno a 100.000. A continuación, siembre las dos diluciones más altas en placas de 10 centímetros utilizando bolas de vidrio para asegurar una distribución uniforme e incube las placas durante la noche. Al día siguiente, cuente el número de colonias en la placa mediante observación directa o mediante software de conteo de colonias.

Luego, calcule el número de unidades formadoras de colonias por mosca. Este ensayo utiliza moscas transgénicas que portan el reportero de luciferasa kappa b en el momento adecuado. El ensayo también requiere bacterias cultivadas, como SCIA, preparadas para inyección según se describió en la sección anterior.

Ajuste las moscas a las condiciones experimentales de iluminación. En este ejemplo, moscas de luciferasa kappa b de uno a cuatro días de edad se mantienen en viales que contienen medio alimenticio con 5% de sacarosa y 2% de agar, y se colocan bajo luz constante durante dos días. Ahora prepare una microplaca de 96 pocillos para las moscas.

Rellene cada pocillo con dos capas de alimento. Primero el medio: añada 300 microlitros de una solución de sacarosa al 5% y agar al 2% a cada uno. Luego, cubra la placa con un paño de malla fina y deje que se seque completamente durante hasta una hora.

A continuación, agregue una capa superior de 50 microlitros a cada pocillo que contenga 5% de sacarosa, 1% de agar y dos milimoles de Lucifer. Dado que Lucifer es sensible a la luz, deje secar la placa en la oscuridad a partir de este momento. Minimice la exposición de la placa a la luz.

Una vez que el agar haya enfriado, cubra la placa con una película adhesiva transparente. Luego, utilizando una aguja fina, perfore la película dos veces sobre cada pocillo. Estos orificios permiten el intercambio de aire y la anestesia gaseosa.

A continuación, para facilitar la carga de las moscas, utilice una cuchilla afilada y una regla para hacer un corte entre cada columna. Anestesie las moscas con dióxido de carbono y colóquelas una por una en cada pocillo, columna por columna. Si una mosca queda atrapada en la película, déjela intentar liberarse antes de intervenir.

Devuelva la placa de microplacas al incubador bajo luz constante durante ocho a 24 horas. Para anestesiar las moscas adheridas a los pocillos, utilice una punta de micropipeta conectada a una línea de dióxido de carbono de baja presión. Asegúrese de que el gas esté a una presión lo suficientemente baja como para no causar daño y coloque la punta de micropipeta directamente sobre los orificios de ventilación para anestesiar una mosca en grupos de ocho individualmente.

Transfiera cada mosca a una placa de CO2 e inféctelas con bacterias como se indicó anteriormente. Luego, devuelva cada mosca a su pocillo original y selle nuevamente la microplaca. Mida la luminiscencia en cada mosca utilizando un luminómetro ubicado en una habitación con temperatura controlada y bajo un horario de iluminación definido.

Cargue las placas en el casete apilador, asegurándose de colocar las placas que contienen las moscas entre placas en blanco transparentes. Programe el luminómetro según las especificaciones del fabricante y registre lecturas cada hora durante un mínimo de 24 horas. En este ejemplo, los detectores están programados para leer cada pocillo durante 10 segundos.

Una vez finalizado, exporte los archivos de datos a una hoja de cálculo y realice un análisis estándar graficando los resultados. Pueden analizarse los datos de ejemplo. Descuentos por segundo promediados a partir de tres lecturas por pocillo.

Se cargaron moscas silvestres Canton S y moscas mutantes relish. E 20 deficientes en el gen NF kappa B en dos monitores de actividad en luz constante e infectadas con sia. En este ejemplo, la infección promovió el sueño.

Quedó claro que los mutantes relish E 20 presentaron menos sueño que los moscas Canton s. tras la infección. En concordancia con hallazgos previos, los mutantes relish E 20 también sucumbieron rápidamente a la infección en comparación con las moscas de tipo silvestre.

La mayoría de las moscas sobrevivieron a la inyección control aséptica, lo que indica que las moscas sucumbieron a la infección y no a la lesión causada por la inyección. Debido a que los mutantes relish murieron tan rápidamente, solo se utilizaron moscas Canton s para demostrar la carga bacteriana tras la infección. Sia continuó proliferando en la mosca 24 horas después de la infección.

La actividad del reportero Lucifer mostró una gran variación entre moscas individuales y entre el éxito de los puntos de datos. Aunque la señal se deriva de todos los tejidos dentro de la mosca, no se espera que cada tejido emita la misma cantidad de señal, y la visibilidad del tejido para el detector variaría conforme la mosca se mueve. En este ejemplo, las moscas fueron infectadas y comparadas con un grupo control manipulado.

Las moscas que murieron fueron excluidas del análisis en un grupo de moscas. La actividad del reportero de Luciferasa Kappa b aumentó progresivamente tras la infección. La actividad del reportero de Luciferasa Kappa b también aumentó progresivamente tras una lesión aséptica.

La actividad máxima fue de aproximadamente 12 horas tanto después de la lesión como después de la infección. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la función inmune y el sueño en SSO tras una infección. Podemos medir el sueño, la supervivencia, el tiempo, la eliminación bacteriana y la actividad en tiempo real de un reportero de transcripción no copiado.