El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo

Este video demuestra un procedimiento para identificar genes que regulan el crecimiento del verme y el tamaño corporal. Utilizando interferencia de ARN o ARN de interferencia para inactivar genes candidatos, primero se preparan placas que contienen bacterias que expresan ARN bicatenario, que tiene como diana los genes de interés. Se transfieren hermafroditas en el cuarto estadio larval a las placas de ARNi.

Una vez que alcanzan la etapa de adultos jóvenes, se transfieren a nuevas placas de ARNi para que depositen huevos. Después de varias horas, se retiran, dejando poblaciones sincronizadas de embriones. En la etapa deseada de desarrollo, se recoge la descendencia y se monta sobre portaobjetos.

Finalmente, se adquieren imágenes microscópicas de los gusanos. El análisis de la imagen demuestra cambios en el tamaño corporal provocados por la inactivación génica. Aunque este método puede utilizarse para identificar reguladores de la vía de señalización TGF beta, también puede aplicarse a otras vías que regulan el desarrollo pos-embrionario en *C. elegans*, como la vía de señalización de la insulina.

Comience este procedimiento clonando las secuencias del gen diana en el vector L 4 4 4 0 A, un plásmido comúnmente utilizado para ARNi en gusanos. Transforme el plásmido recombinante en la cepa bacteriana HT one 15 DE three. Cultive las bacterias transformadas en placas de agar LB con 25 microgramos por mililitro de carbenicilina y 12,5 microgramos por mililitro de tetraciclina, y luego seleccione un clon individual para su uso futuro.

Mientras tanto, transforme el vector vacío L 4 4 4 0 en la cepa bacteriana HT one 15. Para utilizarlo como control en los cultivos del experimento, transforme las bacterias en un mililitro de caldo LB con 100 microgramos por mililitro de ampicilina durante la noche a 37 grados Celsius.

La tetraciclina no se añade porque disminuye la eficiencia del ARNi. Añada otros cinco mililitros de caldo LB con 100 microgramos por mililitro de ampicilina a la cultura nocturna y luego incube durante otras cuatro a seis horas a 37 grados Celsius. Una vez que la cultura esté lista, siembre 0,5 mililitros de bacterias experimentales o de control en las placas de gusanos de ARNi etiquetadas con el nombre del clon correspondiente.

Se deben preparar al menos dos placas para cada condición. Incubar las placas durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente.

Debe estar presente un césped bacteriano que exprese ARNi con o sin la secuencia del gen diana. Los animales utilizarán las bacterias como fuente de alimento. Una vez que las placas de alimentación con ARNi estén listas, se esteriliza con llama la punta de un alambre de platino.

Luego, utilice el alambre de platino para transferir de seis a diez estadios larvales cuartos o L4 de C. elegans hermafroditas a cada placa de ARNi. Deje que los hermafroditas crezcan a 20 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, los animales serán adultos jóvenes.

Trasférilos a una nueva placa de RNAI adecuadamente etiquetada y preparada. Incube las placas a 20 grados Celsius durante cuatro a seis horas para permitir que los adultos depositen huevos. Tras la incubación, retire todos los adultos de la placa para sincronizar la descendencia.

Una vez eliminados los adultos, comience a contar el tiempo. Este es el tiempo cero. Incube las placas a 20 grados Celsius para permitir que los animales crezcan hasta la etapa de desarrollo de interés.

Aquí, se elegirán adultos jóvenes para el análisis fenotípico. Para los silenciamientos que se desarrollen a una velocidad normal, se requiere una incubación de 72 horas. Téngase en cuenta que diversos genes afectan el desarrollo del animal de manera diferente, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos de incubación.

Si el ARNi hace que los animales crezcan a una velocidad diferente, los adultos jóvenes pueden identificarse como aquellos que no superen las 24 horas posteriores al estadio L4, con desarrollo vulvar completado y entre dos y seis embriones en el útero, tal como se muestra aquí. Para identificar otros estadios de desarrollo, el investigador debe utilizar el desarrollo gonadal y vulvar como guía. Una vez que los animales hayan alcanzado el estadio adecuado, prepárese para evaluar los fenotipos de tamaño corporal de los gusanos tratados con ARNi.

A continuación, coloque dos capas de cinta adhesiva de etiqueta de color sobre un portaobjetos de vidrio de un milímetro de espesor, como se muestra aquí. Prepare dos de estos portaobjetos de vidrio. Luego, coloque un portaobjetos de vidrio nuevo entre los dos portaobjetos con la cinta y agregue una gota de Agros al 2% fundido en agua.

En el centro del nuevo portaobjetos, presione un segundo portaobjetos encima para formar una almohadilla delgada de agarosa. Una vez que la agarosa se haya solidificado, retire el portaobjetos superior. El portaobjetos con la almohadilla de agarosa está listo para cargar los gusanos.

Etiquete el portaobjetos con el nombre del clon. Añada 10 microlitros de azida de sodio 25 milimolar al tampón aros. Luego, utilizando un alambre de platino como antes, transfiera de 30 a 40 animales a la solución de azida sódica.

Para inmovilizarlos, coloque una laminilla encima. Haga esto tanto para los animales recombinantes como para los que portan L 4 4 4 0 vacío y han sido tratados con ARNi. A continuación, coloque la platina micrométrica bajo el microscopio estereoscópico con un objetivo de 2,5 x.

Utilizando Q Capture o un software similar, capture una imagen de la regla micrométrica y guárdela. Luego, coloque los gusanos bajo el microscopio y capture imágenes. Para medir primero la longitud del cuerpo, abra la imagen de la regla micrométrica en el software Image Pro.

Luego haga clic en medir y seleccione calibración. A continuación, elija el asistente de calibración espacial con la imagen activa seleccionada para calibrar. Haga clic en siguiente.

Introduzca el nombre para la calibración y asegúrese de que las unidades de referencia espacial estén establecidas en micrones. Luego, marque la casilla Crear una calibración de referencia y haga clic en Siguiente. Haga clic en dibujar línea de referencia.

Aparecerá una barra de escala de referencia. Reposicione la barra de escala para que coincida con los extremos del micrómetro. Luego indique que la referencia indica 1000 unidades.

Haga clic en aceptar. Siguiente y finalizar. Una vez que el software esté calibrado, abra una imagen de un gusano.

Luego, en el menú de medida, seleccione calibración y después haga clic en seleccionar espacial. En el menú desplegable, seleccione el nombre de archivo creado para la calibración del micrómetro. A continuación, en el menú de medida, seleccione mediciones en la ventana que se abre.

Seleccione la herramienta de dibujo libre y, utilizando el ratón de la computadora, trace una línea a través del centro del cuerpo del animal desde la cabeza hasta la cola. La longitud se mostrará en la ventana. Repita este procedimiento para todos los animales en el campo.

Exporte las mediciones de longitud a un archivo de Microsoft Excel u otro software estadístico adecuado. Analice los datos calculando la media y la desviación estándar para cada muestra. Luego compare los resultados de cada grupo utilizando una prueba t de Student.

La proteína DBL uno de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta o TGF beta es necesaria para la activación de la vía de señalización de TGF beta. En respuesta a la activación de la señal, los transductores de señal intracelulares Smad translocan al núcleo e inician la transcripción génica. Los ejemplares en los que la vía de TGF beta está alterada presentan un tamaño corporal más pequeño, incluyendo una longitud corporal más corta que los animales de tipo silvestre.

Así, los análisis en Caenorhabditis elegans permiten identificar componentes y modificadores de la señalización TGF beta, así como evaluar la eficacia del ARNip mediante alimentación para la identificación de mutantes de tamaño corporal. El ARNip se utilizó para reducir los componentes de la vía DBL-1, SMA-3 y SMA-6, en cuatro cepas diferentes de Caenorhabditis elegans.

Las cepas de C. elegans analizadas incluyeron dos cepas hipersensibles a ARNi: A uno, Lin 15 B y RF tres, así como la cepa silvestre estándar N dos y la cepa LIN 36, cuya sensibilidad al ARNi es similar a la de N dos, como se muestra aquí. Cuando se interrumpió la expresión de SMA tres o SMA seis, los animales presentaron un tamaño corporal significativamente más corto que los animales control, excepto en el ARNi de SMA seis en Lin 36. Fondo en RF tres.

Las longitudes del cuerpo de adultos jóvenes tras el tratamiento con ARNi fueron del 84 al 95 % de las obtenidas con el vector solo. En un fondo A one Lin 15 B, las longitudes del cuerpo de adultos jóvenes tras el ARNi fueron del 68 al 86 % de los animales control. Sin embargo, la cepa A one lin 15 B produce poca descendencia.

Esto los hace inadecuados para cribados a gran escala. Por lo tanto, se sugiere el uso de la cepa RF de tres cepas para estas técnicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar genes que regulan el crecimiento y el tamaño corporal utilizando la técnica de interferencia por RNI.