El objetivo general de este procedimiento consiste en aislar vesículas F1 F cero APAs del cerebro de rata para realizar grabaciones mediante el método de "patch clamp". Esto se logra primero extrayendo el cerebro de una rata y homogenizándolo. El segundo paso consiste en interrumpir las zonas sinápticas aplicando presión.

A continuación, los sinaptosomas se colocan en capas sobre los gradientes de frascos. El último paso consiste en incubar con digitonina y L para obtener las vesículas finales destinadas a la grabación mediante el método de "patch clamp". Una función importante de las mitocondrias es la producción de ATP mediante fosforilación oxidativa.

La enzima responsable de la producción de TP es la ATP sintasa ubicada en la membrana interna mitocondrial. Para estudiar en detalle la función de la ATP sintasa, aislamos unas vesículas submitocondriales especiales que denominamos SMVs. Estas contienen la enzima ATP sintasa en una configuración invertida (de adentro hacia afuera).

Luego registramos estos VMPS con un electrodo de registro por parche y determinamos la permeabilidad de su membrana. Esto nos indica la eficiencia de la producción de TP por parte de las mitocondrias. Hoy, Sylvia Ti, investigadora posdoctoral en mi laboratorio de la Universidad de Yale, demostrará este procedimiento.

En este procedimiento, tras obtener la cabeza de una rata mediante decapitación, corte la piel para exponer el cráneo y luego abra el cráneo suavemente cortándolo con un par de tijeras o Rons. Posteriormente, retire el cerebro, pique el cerebro sin el cerebelo finalmente aislado, tampone y luego transfiéralo a un homogenizador de vidrio y teflón de cinco mililitros; homogenice suavemente el tejido 10 veces, aproximadamente cinco minutos en total. Después de eso, centrifugue la muestra a 1.500 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius en una centrífuga de banco.

Guarde el sobrenadante con mitocondrias y sinaptosomas y deseche el sedimento. A continuación, centrifugue nuevamente a 16.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius en una centrífuga de mesa. Luego, deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 500 microlitros de tampón de aislamiento. Rompa los sinaptosomas utilizando un recipiente de ruptura celular aplicando una presión de 1.200 PSI durante 10 minutos, seguido de una descompresión rápida. Aplique las zonas sinápticas disruptadas sobre los tubos de centrífuga con dos concentraciones diferentes de fial que formarán dos capas.

A continuación, coloque los tubos en un rotor SW 50.1 y centrifugue a 126.500 ×g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. En una ultracentrífuga, el sedimento es la mitocondria purificada. La capa entre las diferentes densidades del fial es el sinaptosoma no interrumpido.

A continuación, lave el precipitado mediante centrifugación en tampón de aislamiento a 16.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius en una centrífuga de sobremesa. Ahora, resuspenda las mitocondrias en 200 microlitros de tampón de aislamiento, combinado con un volumen igual de digitonina al 1 %.

Colóquelo en hielo durante 15 minutos. A continuación, agregue más tampón de aislamiento y centrifugue a 16.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Repita este procedimiento dos veces, luego resuspenda el pellet en 200 microlitros de tampón de aislamiento y agregue dos microlitros de 10 % Lu bra, PX, mezcle y coloque en hielo durante 15 minutos.

Después de eso, coloque la mezcla en capas en el tampón de aislamiento dentro de los tubos de centrífuga. Coloque los tubos en un rotor SSW 50.1 y centrifugue a 182,000 ×g a cuatro grados Celsius durante una hora. Después de una hora.

Lave la paleta final centrifugándola en tampón de aislamiento a 16.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Un equipo típico de electrofisiología incluye un amplificador, un ordenador PC equipado con un digi data 1,440, una interfaz conversora analógica-digital junto con manipuladores de software P clamp 10.0, un microscopio, una mesa de aislamiento de vibraciones y una jaula de Faraday. Primero, tire de un pipeta a partir de un tubo capilar de vidrio borosilicatado en un tirador de micropipetas flaming brown.

La resistencia óptima de la pipeta debe estar entre 80 y 100 megaohmios. Añada las vesículas submitocondriales en una solución intracelular fisiológica. A continuación, llene una pipeta para registro de parche con la misma solución.

Visualice las vesículas en contraste de fase. Microscopía después de que las SMV se sellen a temperatura ambiente. Registre la actividad cuando el potencial de membrana se mantiene en un voltaje que varía desde -100 milivoltios hasta +100 milivoltios durante 10 segundos en cada período.

Los datos registrados se filtran a cinco kilohercios utilizando la circuitería del amplificador y se analizan con el software Clampfit 10.0. Esta figura muestra la transferencia de lisado preparado a partir del citosol y las mitocondrias. El panel superior muestra una inmunotransferencia utilizando un anticuerpo contra la proteína citosólica GA dh.

El panel inferior muestra una tinción con un anticuerpo contra la proteína de la membrana interna mitocondrial. Cox cuatro Aquí se presentan dos grabaciones representativas de registro de parche antes y después de la adición de un milimolar de a TP. El potencial de sostenimiento es de setenta milivoltios positivos. La línea punteada representa cero picoamperios.

Cada traza se registra durante 10 segundos y hay 10 segundos entre trazas y se muestran. A continuación se muestran trazas de ejemplo de los cambios en la intensidad de fluorescencia del indicador CMA a lo largo del tiempo en presencia de VMs y en ausencia y presencia de una TP. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo aislar mitocondrias y una vesícula submitocondrial que contiene la ATP sintasa F1 FO 80 TP. Además, debería comprender cómo formar un sello resistente de tipo sellado con un electrodo sobre la membrana de la vesícula para analizar la actividad del canal del complejo ATP sintasa.