Estudio cuantitativo de Locomotion libremente Piscina microorganismos utilizando la difracción láser

El objetivo general de este procedimiento es medir las frecuencias de movimiento brusco de organismos microscópicos que nadan libremente. Esto se logra primero preparando una muestra de gusanos microscópicos. A continuación, se prepara el montaje óptico.

Luego se registra el patrón de difracción introducido por los organismos vivos. Finalmente, se analizan los datos registrados para determinar las frecuencias de nado. En última instancia, el análisis de difracción se utiliza para mostrar los cambios en los patrones de locomoción de los gusanos sin restricciones.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía tradicional es que se pueden observar los patrones de nado mientras la especie se mueve libremente en un espacio tridimensional. Aunque este método puede proporcionar información sobre el movimiento libre del nematodo marino, también puede aplicarse a otros organismos transparentes, pequeños y microscópicos expuestos a condiciones variables. Para preparar C. elegans para el análisis de video, comience utilizando una varilla de platino aplanada para transferir de 10 a 20 nematodos adultos GR a un medio NGM fresco.

Placas de Petri con agar que contienen pequeñas manchas circulares de e coli. Deje que los nematodos pongan huevos durante tres a cinco horas, y luego retire los adultos. De este modo, se establece un pequeño cultivo con sincronización del desarrollo de 50 a 150 nematodos. Para hacer crecer los nematodos hasta la etapa temprana de adulto, incube las placas de Petri a 20 grados Celsius durante cuatro a cinco días.

En el día del análisis de video, utilice un mililitro de agua destilada desionizada para enjuagar una placa de nematodos adultos jóvenes, recolectando así entre 50 y 150 gusanos de la cultura sincronizada. Utilice una microcentrífuga para sedimentar los gusanos en el fondo del tubo o déjelos asentar por gravedad durante aproximadamente 15 minutos. Retire la mayor parte del agua del tubo y sustitúyala con un mililitro de agua destilada desionizada para eliminar cualquier bacteria adherida a los nematodos.

Utilizando una pipeta micrométrica, transfiera de cinco a diez nematodos en agua a una celda de cuarzo. Monte el sistema óptico como se muestra aquí, utilizando un láser de helio-neón de 543 nanómetros para sobremuestrear, dos espejos de aluminio de superficie frontal utilizados para dirigir el haz láser a través de la celda, un soporte para celda, una pantalla de proyección y una cámara de alta velocidad capaz de filmar a aproximadamente 240 cuadros por segundo. A continuación, utilice un trozo de parafina para cubrir la parte superior de la celda e inviértala para mezclar los nematodos en la columna de agua.

Coloque el vete en un soporte para vete de manera que los gusanos se sitúen inicialmente cerca de la parte superior del vete. Utilizando los espejos, dirija el haz láser a través del centro del vete. Dado que los nematodos son más densos que el agua, caerán lentamente hacia el fondo del vete mientras nadan dentro de la columna de agua; en la pantalla de proyección, coloree de negro el punto correspondiente al haz láser transmitido para reducir la dispersión cuando el haz transmitido alcance la pantalla de proyección.

Eliminar o reducir la dispersión del haz transmitido evitará que el arreglo CCD de la cámara se sature debido al haz transmitido. Para capturar una medida del tamaño del patrón de difracción, trace una línea de aproximadamente cinco centímetros sobre la pantalla de proyección junto al punto del haz láser transmitido sin interferir con la imagen de la luz difractada. Apague la luz del cuarto y registre las imágenes de difracción en la pantalla mientras los gusanos pasan a través del haz láser.

Para preparar los datos del video, instale el siguiente programa de análisis de video e importe el video al programa. Establezca el origen para que coincida con el punto láser transmitido utilizando el software. Siga el desplazamiento angular de la imagen de difracción formada por cada nematodo.

Copie y pegue los datos en una hoja de cálculo y sume 180 grados o PI a todos los ángulos negativos para obtener una gráfica continua. Utilizando la configuración de análisis de video, coloque un fotodiodo con un área pequeña descentrado en el patrón de difracción directamente frente a la pantalla de proyección mediante un puerto USB.

Conecte el fotodiodo al osciloscopio digital que está conectado al ordenador. Observe los patrones de movimiento brusco en la pantalla del ordenador. Guarde los conjuntos de datos en formato ASCI o de texto para analizar los datos.

Utilice el video o la foto para importar los datos a un programa de análisis de datos capaz de ajustar formas de onda. Mediante el ajuste de minimización de chi cuadrado, ajuste una curva sinusoidal para determinar la frecuencia de sacudidas. Promedie las frecuencias de nado de varias muestras y determine la varianza.

Para este estudio, los datos se analizaron estadísticamente utilizando un factor único Inova, seguido por el Bon Ferran. La prueba de comparaciones múltiples considera un valor de P inferior a 0,05 estadísticamente significativo para modelar los patrones de difracción. Comience utilizando un microscopio para obtener imágenes con el fin de izar una imagen.

Arrástrelo a Mathematica. Utilice el comando de ojos binarios para convertirlo en blanco y negro. Alternativamente, use el comando de detección de bordes para crear una imagen en blanco y negro donde los dos últimos números controlan la grosería de los bordes resultantes.

A continuación, utilizando el comando de datos de imagen, convierta la imagen en una matriz de ceros y unos. Utilice el comando forer para transformar la matriz, luego eleve al cuadrado el valor absoluto de la matriz, y visualice la imagen resultante, que es el patrón de difracción correspondiente a la imagen original. Además, utilice la función logarítmica para ajustar el contraste de la imagen.

Finalmente, compare los patrones de difracción del modelo con los patrones de difracción obtenidos de gusanos nadando libremente. En este ejemplo, se estudiaron *Euplana elegans* en una cubeta de cuarzo Q, de un centímetro de ancho, cinco milímetros de espesor y cuatro centímetros de altura. Muestreo de un gusano individual mediante análisis de video.

La frecuencia media de nado obtenida mediante análisis de video en un medio de cinco milímetros de espesor fue de aproximadamente 2,5 hercios. De manera similar, el muestreo de un gusano individual mediante el método de adquisición de datos en tiempo real y un osciloscopio digital arrojó una frecuencia de nado de aproximadamente 2,7 hercios. Este procedimiento puede repetirse con muchos gusanos.

Un estudio detallado de gusanos nadando libremente reveló una frecuencia media de nado de 2,37 hercios en un vete de cinco milímetros. Como era de esperar, la frecuencia de nado es mayor que la de un gusano arrastrándose. Mediante este método de difracción, se ha encontrado que las frecuencias medias de nado de un *Caenorhabditis elegans*, confinado a una lámina de microscopio, coinciden con el valor publicado previamente de dos hercios.

Después del video. La preparación de datos y la modelización de patrones de difracción demostrados en este video permiten la modelización de patrones de difracción en movimiento. Con la ayuda de imágenes de gusanos obtenidas con un microscopio convencional, los patrones de difracción modelados se utilizan para simular un ciclo de nado de la elegancia marina.

Un modelo exitoso consiste en un éxito físicamente factible de los patrones de nado, que coincidan con las frecuencias de nado. El gusano debe tener la misma forma al final del ciclo de nado que al comienzo del ciclo de nado. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de un minuto para cada gusano utilizando la dieta fotográfica rápida mientras se observan los ciclos de nado en la pantalla del ordenador.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar nematodos que nadan libremente.