Aislamiento y análisis de Brain-secuestrados Los leucocitos de Plasmodium berghei ANKA de ratones infectados

El objetivo general de este procedimiento es aislar los leucocitos inflamatorios adherentes de los vasos sanguíneos cerebrales de ratones infectados con Plasmodium Burge Eye Anca para inducir malaria cerebral experimental. Los ratones se infectan con blastodium berge eye anca glóbulos rojos parasitados por inyección. Después de que los ratones comienzan a mostrar signos de enfermedad, las células circulantes de los ratones infectados con malaria se eliminan por perfusión intraoral.

A continuación, se extraen los cerebros y el tejido se digiere con enzimas para permitir el aislamiento de los leucocitos inflamatorios. A continuación, se realiza una citometría de flujo multicolor para el inmunofenotipo. El análisis de los leucocitos secuestrados en el cerebro de los datos resultantes revela el porcentaje y el número absoluto de leucocitos que migran al cerebro de los ratones infectados con malaria.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patogénesis de la malaria, como qué tipo de células inflamatorias migran al sitio de secuestro del parásito en el cerebro de los animales infectados en diferentes condiciones experimentales. La demostración visual de este método es fundamental. Los pasos de perfusión son difíciles de aprender, ya que requieren rapidez y cuidado para no dañar ningún vaso sanguíneo significativo. Leanna Mcic, una técnica en animales, la Sra. Victoria, Rick, estudiante de doctorado, y la Dra. Lisa Aez, postdoc de mi laboratorio, demostrarán algunas partes de este procedimiento.

Comience este protocolo infectando a los ratones con p berge eye anca desfrost, una alícuota criopreservada de glóbulos rojos parasitados o pbcs de P berge eye anca permitiendo que alcance la temperatura ambiente. Retire a un ratón donante de ocho a 12 semanas de edad de su jaula y colóquelo en una estación de trabajo. Agarra el pescuezo entre el dedo índice y el pulgar.

Dé la vuelta al ratón e inyecte de 100 a 200 microlitros de plasmodium berge eye en la cavidad peritoneal. Rutinariamente, se inyectan pbcs a dos ratones donantes. Después de inyectar, coloque a los ratones en su jaula cuatro o cinco días después de la infección.

Retire un ratón donante de su jaula y colóquelo en una estación de trabajo. Coloque una gota de sangre de la vena de la cola del ratón cerca del extremo de un portaobjetos de microscopio extremo esmerilado. Coloque un segundo portaobjetos en un ángulo de 45 grados y vuelva a colocarlo en la gota de sangre.

Una vez que la sangre se esparza a lo largo del borde, empuje el portaobjetos del esparcidor de manera uniforme a través del portaobjetos del microscopio para hacer que la sangre se manche. Deje que el frotis se seque al aire para fijar los frotis de sangre. Sumerja los portaobjetos en metanol al 100% durante 30 segundos.

A continuación, tiñe los portaobjetos en GIM ZA recién preparado durante 10 minutos después de teñir con gim za, enjuague el portaobjetos con agua corriente durante 30 segundos. Deje que el portaobjetos se seque al aire, luego examínelo bajo el microscopio con la lente de inmersión en aceite de 100 x. Enumere el PRBC dentro de mil eritrocitos y calcule el porcentaje si el ratón donante ha alcanzado los niveles requeridos de 2.5 a 5%Parsit Recolectar sangre del ratón donante por punción cardíaca bajo anestesia o sangrado retroorbitario utilizando un tubo capilar de microhematocrito heparinizado.

Disolver la sangre en medio RPMI a una concentración final de uno por 10 a los seis PRBC por 0,2 mililitros por ratón. Considere que un hematocrito normal de ratón es aproximadamente seis veces 10 por el noveno glóbulos rojos por mililitro. De hecho, el C 57 experimental de ocho a 12 semanas de edad mató a seis ratones inyectando una vez 10 al sexto PRBC en 0,2 mililitros intraperitoneales como antes.

Para controlar los niveles de Para de ratones infectados, prepare un frotis de sangre como antes. La PARA debe determinarse cada dos o tres días a partir del segundo o tercer día después de la infección a partir del día cinco. Después de la infección en adelante.

Los ratones son monitoreados diariamente para detectar signos de malaria grave una vez que los niveles de Para son superiores al 5% y los ratones muestran síntomas neurológicos alrededor del sexto día después de la infección. Los ratones infectados se sacrifican por inhalación de CO2 e inmediatamente se perfunden con PBS, como se describe en el documento adjunto. El aspecto más difícil de este procedimiento es la perfusión intracardíaca.

Aquí se describen una serie de consejos para la solución de problemas: Con el ratón anclado en una tabla de disección de espuma de poliestireno. Dentro de una bandeja de disección. Limpie el lado ventral con etanol al 70%, luego use tijeras grandes y pinzas para abrir la piel a lo largo de la línea media para exponer la cavidad torácica, pliegue y sujete la piel con alfileres a los lados.

Sujete el esternón con pinzas finas y corte el diafragma y a lo largo de ambos lados del esternón, cortando las costillas. Tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos grandes. Sujeta la caja torácica por el esternón sin apretar junto a la cabeza.

Sujete los ventrículos con pinzas finas y haga una incisión cuidadosa en la aurícula derecha con unas tijeras finas. Inserte la aguja de calibre 23 conectada al sistema de perfusión por gravedad en el ventrículo izquierdo hacia la aorta ascendente. Mientras PBS está funcionando, inserte solo 0,5 centímetros de la punta de la aguja para perfundir el mouse durante cinco minutos o hasta que el efluente esté limpio.

Después de la perfusión interna, diseccione el cerebro y colóquelo en un tubo de centrífuga de 10 mililitros que contenga RPMI. Medio. Coloque el cerebro recién cosechado encima de un colador de celdas de acero inoxidable del tamaño de una malla de 40 a 60 en una placa de Petri que contenga de tres a cinco mililitros de medio de cultivo de tejidos RPMI. Corta el tejido cerebral en pedazos pequeños.

Luego, con un émbolo de cristal, empuje pequeños trozos de tejido cerebral a través del filtro de células. Transfiera el homogeneizado cerebral a un tubo de 10 mililitros y centrifugue a 250 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, deseche el sobrenadante y disuelva el pellet en tres mililitros de RPMI.

Medio que contiene colagenasa D y ADN de cisne. Gire la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente. Elimine cualquier residuo de células empujando la mezcla a través de un colador de células de nailon de 70 micras.

Luego incube en hielo durante cinco minutos después de la incubación en un tubo de 10 mililitros. Superponga cuidadosamente el homogeneizado del cerebro en una centrífuga de cojín de siete mililitros al 30% por llamada a 400 veces G durante 20 minutos a temperatura ambiente con el descanso. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de lisis de glóbulos rojos, tamponar e incubar en hielo durante cinco minutos.

Para lisar las pbcs adherentes, que no se eliminan del cerebro por perfusión intraoral. Agregue nueve mililitros de celdas de lavado de medio RPMI y centrifugue a 250 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Resus suspende los leucocitos secuestrados en el cerebro o BSL que contienen pellets en 50 a 100 microlitros de medio RPMI y transfiere las células a un tubo de microcentrífuga, cuente las células viables bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro y exclusión de azul de trian.

Seis días después de la infección, se pueden recuperar de 20.000 a 100.000 BSL una vez que se han obtenido los recuentos de células viables. Las células se preparan para el análisis por citometría de flujo. Los detalles de este procedimiento se dan en el documento adjunto, pero se resumen aquí primero.

Todas las células aisladas de cada cerebro se centrifugan en un tubo de microfuga de 1,5 mililitros y se resuspenden en un tampón de tinción con anticuerpos bloqueantes anti CD 16 y CD 32. Después de una incubación de 10 minutos en hielo, las células se lavan con tampón de tinción, se centrifugan nuevamente y se resuspenden en un tampón de tinción que contiene anticuerpos fluorescentes anti CD cuatro, anti CD ocho, anti TCR y anti NK 1.1. Las células se incuban en hielo durante una hora lavadas con tinción, tampón y centrífuga.

Después del giro, las células se resuspenden en PBS y se adquieren al menos de 5.000 a 10.000 eventos en un citómetro de flujo. Los datos resultantes se analizan utilizando un software de citometría de flujo adecuado. Las poblaciones de BSL se recuperaron de cerebros de ratones de control perfundidos o perfundidos por la ONU, infectados con malaria y sin previo control, y se tiñeron con anticuerpos PE, anti NK 1.1 y un PC anti TCR beta.

Estos diagramas de puntos muestran porcentajes de células NK, linfocitos T, células NK 1.1 positivas para TCR y células dobles negativas. NK 1.1 TCR negativo negativo en ratones de control perfundidos o no fusionados, infectados con malaria y sin alcohol, lo que concuerda con los hallazgos previos. Las células T alfa beta TCR positivas constituyeron una alta proporción de la reserva de BSL en los cerebros de ratones infectados con malaria perfundida en el sexto día después de la infección.

Esta población parece estar significativamente infrarrepresentada en los cerebros de los animales no perfundidos. La aparente reducción de las frecuencias de células T en cerebros no perfundidos se asoció con un porcentaje y un número total considerablemente mayor de células dobles negativas en estos animales. No solo se detectó un alto porcentaje y número de células dobles negativas en cerebros no perfundidos en ratones infectados con malaria, sino también en controles naïf, lo que sugiere que estas células son leucocitos no inflamatorios presentes en los vasos sanguíneos del cerebro que se recuperan junto con las células inflamatorias si no se realiza la perfusión intracardíaca.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar una amplia profusión intra cardio de ratones infectados antes de la extracción de órganos para evitar la contaminación de los leucocitos secuestrados con células circulantes no inflamatorias. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y analizar leucocitos secuestrados en el cerebro de ratones infectados con plasmodium virga mediante geometría fluida.