Usando cuantitativa en tiempo real PCR para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo Trasplante de médula ósea murina

El objetivo general de este procedimiento es llevar a cabo una técnica basada en PCR para cuantificar el injerto de células de donante en un modelo competitivo de trasplante de médula ósea murina, esto se logra realizando primero el trasplante de médula ósea en ratones receptores hembra utilizando células de donantes macho. A continuación, se recolecta sangre periférica de ratones receptores en diferentes puntos de tiempo y se aísla el ADN genómico. Las muestras se preparan para una curva estándar.

Por último, se realiza la PCR en tiempo real con muestras estándar y muestras de prueba. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el injerto de células derivadas de donantes masculinos en los ratones receptores hembra mediante el cálculo contra una curva estándar con un porcentaje conocido de ADN masculino frente a femenino. La ventaja masculina de esta técnica sobre el método existente, como el método basado en citometría de flujo, es que es más sensible, más económico y las muestras se pueden almacenar durante mucho tiempo.

Lo más importante es que nuestra técnica es más independiente de las cadenas y se puede utilizar para cualquier fondo genómico de ratones, como un marcador de superficie celular bien definido para diferenciar la célula donante de las células receptoras. Después de sacrificar FVB nj, los ratones donante macho y hembra bajo una campana de flujo laminar usan tijeras pequeñas y pinzas para diseccionar los huesos del fémur y la tibia y colocarlos en una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros que contiene seis mililitros de hielo RPMI 1640 con 5% de calor inactivado. FBS usa una toallita Kim para eliminar el músculo y otros tejidos y cortar ambos extremos de cada eje óseo en el plato. A continuación, conecte el extremo de los huesos a una aguja de calibre 23 conectada a una jeringa de tres cc llena de RPMI 1640 con FBS inactivado por calor al 5% y enjuague la médula.

Utilice la misma aguja para disgregar el tejido de la médula ósea mediante aspiraciones repetidas. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y gírelo hacia abajo durante cinco minutos a 400 G. Después de quitar el supernat, vuelva a suspender las células en un mililitro de temperatura ambiente, lisis de glóbulos rojos, tampón e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de agregar de cinco a 10 mililitros de RPMI 1640 con FBS inactivado por calor al 5%, pase las células a través de un filtro de celdas y recoja el flujo a través de un nuevo tubo. Después de girar las células durante cinco minutos a 400 G y eliminar el sobrenadante, el pellet debe estar ausente de color rojo que indica la eliminación completa de los glóbulos rojos resuspendidos en 10 mililitros de RPMI 1640 con FBS inactivado por calor al 5% después de un vórtice suave, agregue una pequeña alícuota a un hemocitómetro y cuente las células.

Calcule el volumen de células necesarias para mezclarse con las células femeninas de la competencia en una proporción de cinco a dos para el trasplante de médula ósea. Como paso final para preparar las células para la inyección, mezcle las células del donante y de la competencia, granule las células lavadas con PBS y vuelva a suspender en PBS a una concentración final de cinco veces 10 a la sexta por mililitro de células donantes y de dos veces 10 a la sexta por mililitro para las células competidoras, de cuatro a seis horas antes del trasplante de médula ósea. Irradiar ratones receptores hembra con radiación gamma de cesio 1 37 a una dosis única de 11 grises.

Coloque los ratones hembra irradiados en un retenedor de ratones e inyecte las células mixtas del donante y de la competencia a través de la vena de la cola en un volumen total de 0,1 mililitros, de modo que cada ratón reciba cinco veces 10 a la quinta células del donante y dos veces 10 a la quinta células de médula ósea competidoras para extraer muestras de sangre. Después de la anestesia, los ratones recogen unos 50 microlitros de sangre en tubos recubiertos de EDTA mediante sangrado retroorbitario. También recoja muestras de ratones machos y hembras de la misma edad.

A continuación, aislar el ADN genómico de ratones y ratones. Para la curva estándar, agregue aproximadamente 200 microlitros de tampón de lisis RBC a temperatura ambiente a cada muestra de sangre e incube durante cinco minutos. Agregue un mililitro de PBS y gire hacia abajo para eliminar la mayoría de los glóbulos rojos lisados.

A continuación, utilice un kit de extracción de ADN sanguíneo para aislar el ADN precalentando el tampón elucian a 37 grados centígrados. Para mejorar el rendimiento, mida la concentración de ADN de cada muestra. Para un análisis más detallado se utilizan aquellos con una relación OD dos 60 a dos 80 entre 1,8 y 2,0.

Para establecer una curva estándar, diluya el ADN masculino y femenino a una concentración de cuatro nanogramos por microlitro y prepare la mezcla de ADN de acuerdo con estas pautas. Configure la placa de reacción de PCR mezclando el reactivo de súper mezcla verde cibernético con los cebadores que se muestran aquí y el ADN genómico. Cada reacción de 20 microlitros contiene 400 nano molares de cada cebador y cinco microlitros de ADN genómico de células sanguíneas por triplicado.

Realice la PCR de acuerdo con las condiciones que se encuentran en el protocolo de texto y obtenga los valores de umbral de ciclo o CT. Calcule el delta CT por la cantidad, CT elevado a la potencia de ZY uno menos CT elevado a la potencia de BCL, dos y los niveles de expresión de ZY uno, o dos elevados a menos delta CT, genere curvas estándar trazando la media del triplicado dos elevado a la potencia de los valores de delta CT al porcentaje conocido de ADN masculino en la mezcla con un ajuste de regresión lineal mostrado. A continuación, se muestran ejemplos de curvas estándar trazadas con valores medios de dos elevados a la potencia de delta CT frente a porcentajes de ADN masculino.

Este gráfico incluye una temperatura de fusión específica para los amplicones BCL dos y ZFY uno localizados a 78,5 y 88,5 grados Celsius respectivamente. BCL two se utiliza como gen de referencia para normalizar la cantidad total de ADN cargado en cada reacción de PCR. BCL: dos curvas de amplificación para cada muestra estándar se fusionan entre sí independientemente de la concentración de ADN masculino, lo que indica cantidades iguales de ADN cargado.

Sin embargo, las curvas de amplificación ZFY one migraron hacia la izquierda con cantidades crecientes de ADN masculino en la muestra de células madre hematopoyéticas de ratones PIM TKO tienen defectos en la reconstitución de ratones irradiados letalmente y, como se esperaba, los ratones receptores trasplantados con células PIM TKO tenían un porcentaje mucho menor de células masculinas en comparación con los ratones trasplantados con células de tipo salvaje. Para validar nuestro método, probamos el injerto de células de donante masculino en ratones hembra trasplantados, recibiendo células de médula ósea de tipo salvaje frente a ratones PIM triple knockout o TKO en diferentes puntos de tiempo después del trasplante, tanto sangre periférica a las seis semanas como muestras de médula ósea a las 16 semanas. Fueron analizados Después de ver este video.

Debe tener una buena comprensión de cómo utilizar el método basado en PCR para cuantificar el injerto de células del donante en un modelo competitivo de trasplante de médula ósea marina.