Enfoques Forward genéticos en Chlamydia trachomatis

El objetivo general de este procedimiento es realizar análisis genéticos en Chlamydia tritus mediante la realización de mutagénesis química y la determinación de asociaciones genotípicas y fenotípicas. Esto se logra generando primero cepas mutantes de Chlamydia tracom mediante mutagénesis química. A continuación, se identifican todas las mutaciones generadas por sustancias químicas mediante la secuenciación del genoma completo, seguida del ensamblaje del genoma guiado por referencia.

A continuación, se identifican las asociaciones genotípicas del fenotipo en las cepas mutantes. Finalmente, se confirman las asociaciones genotípicas del fenotipo generando cepas recombinantes y analizándolas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que una mutación en un gen particular de clamidia conduce a un fenotipo de interés a través de una combinación de enfoques clásicos de mutagénesis química y Singh de próxima generación.

Actualmente no existen métodos disponibles para el reemplazo de genes en clamidia y las herramientas genéticas moleculares para su estudio están en pañales. Este método no requiere transformación con ADN recombinante ni el desarrollo de herramientas genéticas moleculares, pero logra el mismo objetivo. Se trata de una asignación de función a productos genéticos individuales.

Para preparar las células cultivadas, se asientan aproximadamente una vez 10 de las seis células vir por cada 25 centímetros cuadrados en tres mililitros de DMEM suplementado con 10% de FBS, incuban a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Cuando las células alcancen la confluencia unas 24 horas más tarde, aspire el medio e infecte las células con clamidia en una multiplicidad de infección de cinco. En un volumen total de tres mililitros de D-M-E-M-F-B-S que contenga 200 nanogramos por mililitro de cicloheximida para iniciar la mutagénesis a las 18 horas después de la infección bajo una cubierta química, prepare 20 miligramos por mililitro de sulfonato de etilo metano o EMS en PBS con cloruro de calcio y cloruro de magnesio.

El EMS es un potente mutágeno y carcinógeno. Por lo tanto, consulte el protocolo de texto para su eliminación. Aspirar el medio de las células Vero y lavarlas una vez con tres mililitros de PBS con cloruro de magnesio y cloruro de calcio.

A continuación, a tres mililitros de solución EMS e incubar durante una hora en la campana extractora a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el EMS y colóquelo en un recipiente con un molar de hidróxido de sodio para inactivar el mutágeno antes de lavar las células tres veces para eliminar cualquier EMS residual. Luego, a seis mililitros de DMEM 10%FBS con 200 nanogramos por mililitro de cicloheide y 25 microgramos por mililitro de gentamicina e incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 48 a 72 horas.

Las inclusiones parecen desprovistas de bacterias aproximadamente 36 horas después de la mutagénesis a las 72 horas. Alrededor del 10% de las inclusiones están llenas de bacterias mientras que el resto permanece vacío para extraer cuerpos elementales o EBS por lisis hipotónica aspirar completamente el medio. Agregue un mililitro de agua y balancee durante 10 minutos para desalojar las células, licícelas pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces.

Después de recoger el lisado en un tubo de microfuga, agregue 0,25 mililitros de cinco x sacarosa, tampón de fosfato glutamato o SPG a una concentración final de uno x y almacene a menos 80 grados Celsius. Coloque capas mono confluentes de células ves en placas de seis pocillos sembrando aproximadamente 0,4 veces 10 de las seis celdas en tres mililitros de DMEM 10% FBS por pocillo, permitiendo que las células formen una monocapa homogénea durante las próximas 24 horas. El próximo otoño en hielo, una solución madre de clamidia mutágena.

A continuación, prepare seis tubos de dilución en serie diez veces en un volumen total de 200 microlitros por dilución en DMEM 10%FBS, y colóquelos en hielo. Use tres mililitros por pocillo de PBS para lavar las células Vero dos veces. A continuación, añada tres mililitros de DMEM a cada pocillo para seis placas de pocillos y 100 microlitros de la dilución bacteriana por duplicado.

Gire el plato para asegurar una mezcla uniforme. Centrifugar las placas infectadas a 2.700 GS durante 30 minutos a 15 grados centígrados. Luego incubarlos a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% durante una o dos horas.

Mientras tanto, prepare 0.54%AROS en DMEM combinando primero los siguientes ingredientes y mezclando. A continuación, mezcle 18,9 mililitros de estéril caliente, 1,2%aros en agua revolviendo para evitar grumos. Mantenga la mezcla tibia en un baño de agua a 55 grados centígrados.

Aspire la suspensión bacteriana de los platos y agregue seis mililitros de la solución de aro tibia. Deje que se solidifique completamente a temperatura ambiente fuera de la campana. Luego, en la campana de bioseguridad con las tapas quitadas, seque las placas durante 15 minutos adicionales cuando las placas se hayan secado, incube a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante siete a 10 días.

Las placas deben ser visibles con la ayuda de un microscopio de disección un día antes de aislar a los mutantes. Ver uno por 10 a las cuatro celdas cero en 100 microlitros por pocillo. En una placa de 96 pocillos, las células confluirán en 24 horas.

Bajo un microscopio de disección, marque las placas que se van a recoger y luego use una pipeta de barrera estéril de un mililitro para recolectar tapones de placas. Resus suspende las placas en 100 microlitros de DMEM suplementado con 10%FBS 400 nanogramos por mililitro, ciclo, heide y 50 microgramos por mililitro. Gentamicina para expandir las cepas mutantes, superponga la suspensión sobre monocapas confluentes de células Vero.

Gire las placas a 2.700 GS y 15 grados Celsius durante 30 minutos antes de incubar las placas de cosecha cuando más del 50% de las células estén infectadas, lo que puede ocurrir tan pronto como 48 horas después de la infección y hasta 14 días. Esta cantidad de células infectadas permite almacenar suficientes bacterias viables para extraer las VE mediante lisis hipotónica de las células infectadas. Después de aspirar el medio a 160 microlitros de agua estéril e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Utilice las puntas de barrera para interrumpir las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces para garantizar una lisis completa. Finalmente, transfiera 160 microlitros de cada lisado a tubos de micro fuga. Agregue 40 microlitros de cinco XSPG y almacene a menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para analizar y evaluar los mutantes en busca de fenotipos de interés.

La exposición al mutágeno conduce a inclusiones que parecen desprovistas de bacterias, presumiblemente debido a la muerte de las células bacterianas. Por lo general, serovar LGVL dos piará completamente las células infectadas dentro de las 48 horas posteriores a la infección, pero el tratamiento con mutágenos puede extender este ciclo a más de 90 horas, y se espera que alrededor del 10% de las inclusiones se recuperen en nuestros experimentos. Las células Vero infectadas tratadas con 20 miligramos por mililitro de EMS condujeron a una disminución del 99% en la recuperación de la progenie infecciosa en comparación con los controles no tratados, como se ve en esta figura.

El tratamiento con mutágenos también condujo a la aparición de placas con morfologías alteradas, incluidas placas pequeñas. Otras morfologías incluyen placas que parecen granulares, grumosas o en forma de panal, como se muestra aquí. Las dosis de EMS utilizadas en estos estudios pueden dar lugar a entre tres y 30 mutaciones por genoma de KCL, según lo evaluado experimentalmente por NGS.

Aunque los EBS purificados en gradiente están en gran medida libres de material de la célula huésped, también se detecta el ADN del huésped y comprende alrededor del 10 al 15% de las preparaciones genómicas siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar cribados de fenotipos como el deterioro de la replicación en células de cultivo de tejidos, la pérdida de actividades bioquímicas o la alteración de las morfologías bacterianas para responder a preguntas adicionales como qué factores bacterianos se requieren para la formación y el mantenimiento de la clamidia, factores patógenos.