Generación de Shear Adhesión Mapa Utilizando SynVivo redes microvasculares sintético

El objetivo general del siguiente experimento es obtener un mapa de adhesión pura de la adhesión de partículas celulares a partir de un solo experimento utilizando redes microvasculares sintéticas. Esto se logra recubriendo primero el dispositivo microfluídico con la proteína de interés, en este caso avadon. Como segundo paso, se inyectan partículas biotiniladas en el dispositivo a velocidades de cizallamiento fisiológicas, que se unen al dispositivo recubierto de avadon con patrones diferenciales en función de las tasas de cizallamiento locales.

A continuación, se cuenta el número de partículas unidas para generar un mapa de adhesión pura de las partículas utilizando una base de datos creada computacionalmente de valores de velocidad pura en la red. Los resultados muestran que se puede obtener un mapa de adhesión puro a partir de un solo experimento, lo que resulta en un ahorro significativo de tiempo y reactivos en comparación con las cámaras de flujo de placas paralelas convencionales. La principal ventaja de esta tecnología sobre los métodos existentes, como los canales de flujo lineal, es que podemos generar mapas compartidos a partir de un solo experimento, lo que resulta en un ahorro significativo en costos y tiempo.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la administración de fármacos, como la capacidad de los vehículos de administración de fármacos para unirse a los objetivos deseados. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando usábamos cámaras de flujo de placas de paleta para comprender la lesión celular particular. Sin embargo, en condiciones fluidas, el objetivo de este ensayo es proporcionar información básica sobre la adhesión de las partículas s y las células.

La plataforma syn vivo se puede aplicar a una variedad de otros sistemas, como el cáncer y el SNC, la infección y la inflamación, la trombosis y la disfunción de la microcirculación. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos del dispositivo microfluídico son difíciles de aprender, acostumbrarse a pequeños volúmenes de muestra, y las mejores prácticas para evitar la formación de burbujas se comunican mejor visualmente. La demostración del procedimiento estará a cargo de Ashley Smith, científica investigadora de nuestro laboratorio.

El dispositivo microfluídico SynVivo SMN se compone de dos conjuntos de puertos paralelos, uno para fluir en el recubrimiento de la superficie, las fracciones o las celdas para el asiento, y el otro para ejecutar el ensayo. Para comenzar, sumerja completamente el dispositivo en una placa de Petri que contenga agua desionizada estéril y coloque la placa en el vacío. Desecar Permita que el desecado funcione hasta que se elimine todo el aire de los canales del dispositivo.

Esto debería tomar aproximadamente 15 minutos antes de retirar el dispositivo del agua. Use pinzas de punta fina para colocar el tubo de tigón cebado con agua en cada puerto del dispositivo. El tubo debe tener aproximadamente una pulgada de largo.

El dispositivo ahora se puede extraer del agua con una pipeta o una jeringa. Coloque una gota de agua alrededor de la base de un tubo del puerto de entrada. Retire con cuidado el tubo.

La gota de agua evitará que el aire entre en el dispositivo. A continuación, prepare una jeringa de un mililitro cargada con avadon a una concentración de 20 microgramos por mililitro. Conecte la jeringa a una aguja de acero inoxidable de calibre 24 y sujete el tubo del puerto de entrada que no se utilice con una abrazadera de mordaza.

Inserte el tubo en el puerto de entrada del dispositivo. Inyecte avadon a un caudal de un microlitro por minuto durante 10 minutos para permitir la perfusión completa del dispositivo. Al final del tiempo de flujo.

Sujete todos los tubos con abrazaderas de mordaza y coloque el dispositivo a cuatro grados durante la noche. Deje que el dispositivo alcance la temperatura ambiente. A continuación, coloque el dispositivo en un microscopio de fluorescencia invertida equipado con una platina motorizada y una cámara de alto rendimiento.

Prepare una solución de partículas biotiniladas de dos micras a una concentración de 5 millones de partículas por mililitro en solución salina tampón de fosfato o PBS. Cargue las partículas en una jeringa de un mililitro. Prepare una segunda jeringa de un mililitro de PBS.

Solo cargue cada jeringa en una bomba de jeringa y luego conéctelas a la aguja y al tubo con una jeringa de pipeta. Coloque una gota de agua alrededor de la base del tubo del puerto de entrada y retire con cuidado el tubo utilizado para recubrir el dispositivo. Inserte con cuidado el tubo para partículas biotiniladas y para PBS en cada uno de los puertos de entrada.

A continuación, comience a inyectar partículas biotiniladas a un caudal de 2,5 microlitros por minuto. Supervise el puerto de entrada del microscopio a la primera señal de partículas. Inicie el temporizador y continúe el flujo durante tres minutos.

Al final de los tres minutos, detenga el flujo de partículas biotiniladas mientras simultáneamente inicia el flujo de PBS a un caudal de 2,5 microlitros por minuto. Deje que PBS fluya en el dispositivo durante tres minutos para lavar las partículas no unidas. Para comenzar la adquisición, utilice la función de escaneo de imagen grande en el software de imágenes para adquirir la imagen de todo el dispositivo, luego numere secuencialmente las bifurcaciones en el dispositivo y cree un área circular de interés con el doble del diámetro de los canales.

En este caso, establezca el diámetro del área de interés en 200 micras, ya que el diámetro del canal es de 100 micras. Utilice la función de recuento automatizado del software de creación de imágenes para exportar el número de partículas de cada área de interés a una hoja de cálculo. Del mismo modo, utilice la función de cuenta automatizada para exportar el número de partículas en todo el dispositivo.

Se ejecutan simulaciones CFD y los resultados se almacenan en una base de datos para su posterior análisis. La información incluida en los resultados contiene las tasas de cizallamiento de la pared, la velocidad, el flujo de partículas y la adherencia al dispositivo. La información aquí se utiliza para determinar el número de partículas que se adhieren a cada área de interés dada una entrada definida de una concentración de partículas.

Para generar un mapa de adherencia de cizallamiento, calcule el porcentaje de adherencia como se detalla en el protocolo de texto como paso final. Traza el mapa de adherencia pura utilizando la tasa pura en cada bifurcación de las redes y los valores porcentuales de adhesión. Esta imagen muestra un dispositivo SMN syn vivo típico recubierto de avidan después de la unión de dos partículas biotiniladas de micras.

Tenga en cuenta que las partículas se adhieren preferentemente cerca de las bifurcaciones de la red. Las bifurcaciones numeradas en la red SMN syn vivo se pueden ver aquí. Esta imagen es el mapa de corte de pared de muestra generado por el modelo CFD del dispositivo.

La velocidad de cizallamiento varía en el dispositivo, oscilando entre 250 segundos inversos y 15 segundos inversos, como se observa en la microvasculatura in vivo. Tenga en cuenta que estas velocidades de cizallamiento variables no se pueden obtener simultáneamente en canales microfluídicos lineales, ya que proporcionan una velocidad de cizallamiento constante para cada caudal. El gráfico que se muestra aquí de los valores de la velocidad de corte en cada una de las bifurcaciones de la red revela que los patrones de velocidad de corte son complejos y no se pueden obtener con una relación analítica simple a diferencia de los canales de flujo lineales.

Además, hay múltiples bifurcaciones presentes en la red que caen en el mismo contenedor transparente. Sumándose a la confianza estadística de los datos mostrados. A continuación se muestran ejemplos de resultados del análisis CFD para los flujos de partículas en la red, que se utilizan para calcular los flujos de partículas en las ramas y bifurcaciones de la red experimental.

El mapa de adhesión pura calculado a partir de un solo experimento SMN sinvivo sigue la relación inversa observada a partir de mapas de adhesión pura obtenidos de experimentos de canales lineales. Sin embargo, utilizando un ensayo SynVivo, un solo experimento permite la generación de este mapa puro, mientras que se adquieren múltiples ejecuciones experimentales a partir de los canales lineales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar los dispositivos SynVivo SMN para generar la adhesión compartida a partir de un solo experimento.

Al realizar este experimento, es importante recordar que no se deben introducir burbujas en el dispositivo microfluídico SynVivo SMN después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inflamación estudiaran la interacción del endotelio leucocitario a diferentes velocidades en un solo experimento. En la próxima generación de dispositivos, los investigadores pueden estudiar la adhesión y la migración de los leucocitos en un solo ensayo, algo que actualmente no es posible.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos que investigan la adhesión de fármacos, vehículos de administración de fármacos y células para investigar cuestiones como el efecto fisiológico del flujo en la célula celular, el fármaco celular y la adhesión del vehículo del fármaco.