Identificación de modificaciones post-traduccionales de la proteína vegetal Complejos

El objetivo general de este procedimiento es identificar las modificaciones postraduccionales de las proteínas implicadas en los complejos proteicos vegetales que se expresan de forma transitoria o estable en la plana las etiquetas de proteína de interés. A continuación, extraiga el total de proteínas del tejido de la planta y precipite inmunológicamente la proteína de interés. A continuación, separe las proteínas inmunoprecipitadas en un gel de acrilamida y extraiga y digiera las proteínas de la banda de gel de interés.

Ahora envíe las muestras de proteínas para espectrometría de masas. En última instancia, los resultados de la espectrometría de masas pueden detectar cambios dinámicos en las modificaciones postraduccionales, como la fosforilación. A diferencia de métodos alternativos como la incubación in vitro de quinasa con sustrato, este método expresa proteínas en la sembradora.

Por lo tanto, no tiene que saber qué quinasa es responsable de la fosforilación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vegetal, como cómo se transducen las señales en respuesta al estrés, los cambios ambientales o el reconocimiento de patógenos. Además de la identificación de la fosforilación, sitios de complejos de proteínas de resistencia activada, este método se puede aplicar ampliamente a cualquier modificación postraduccional de cualquier complejo de proteínas vegetales.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no están acostumbradas a trabajar con una gran cantidad de extracto y realizar más pasos del protocolo en un solo día. Para la expresión transitoria, cultive las cepas de agrobacterium tohin hasta la fase estacionaria. Coseche las agrobacterias por centrifugación a 3000 Gs durante cinco minutos.

Vuelva a suspender los pellets y el tampón de infiltración. Búfer. Ahora se infiltra. Plantas de NCOA hamana de cuatro semanas de edad con agrobacterias manualmente usando una jeringa sin aguja de un mililitro o al vacío con 0.02% de surfactante, de dos a cinco días después de la infiltración.

Coseche las hojas infiltradas, las hojas, congélelas en nitrógeno líquido y guárdelas a menos 80 grados centígrados. A continuación, muele 20 gramos de tejido vegetal y nitrógeno líquido utilizando un mortero a 80 mililitros de tampón C frío por 20 gramos. Mezclar bien y descongelar con hielo.

Ahora homogeneizar con tres ráfagas de 10 segundos cada una a toda velocidad. Filtrar el homogeneizado y centrifugar a 30.000 Gs durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Mientras tanto, a 100 microlitros de matriz de afinidad adecuada a 500 microlitros de tampón bloqueador de frío D durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y lavado tres veces con un mililitro de tampón frío D. A continuación, retire el supernado del extracto de hoja y páselo por una jeringa de 0,45 micrómetros.

Filtre en un nuevo tubo sobre hielo. Alícuota el extracto crudo. Para una inmunotransferencia.

Agregue cinco vórtices de búfer de carga de página XSDS y hierva las muestras para desnaturalizarlas. Añadir 50 microlitros de la matriz de afinidad, suspendidos en tampón D a cada tubo. Incubar con rotación suave durante dos horas a cuatro grados centígrados, centrifugar a pellets la matriz de afinidad.

A continuación, tome una alícuota del extracto no unido para realizar un inmunoblot. Deseche el resto de la cuerda, dejando aproximadamente 500 microlitros en el fondo del tubo. Vuelva a suspender la solución de lodo con una punta de diámetro ancho.

Agrupe la solución de suspensión mezclada de ambos tubos en un solo tubo de 1,5 mililitros. Pulse tres veces durante cinco segundos utilizando una centrífuga de sobremesa para precipitar la matriz de afinidad y eliminar el supernat después de tres a cinco lavados con un mililitro de tampón frío D. Retire el exceso de tampón D con una aguja de jeringa eluye con 200 microlitros del tampón de elución adecuado bajo agitación constante. Tire de los tres EIT en un solo tubo.

A continuación, concentra las proteínas utilizando 30 microlitros de vórtice de resina de absorción. Pongámonos de pie durante cinco minutos y precipitemos la resina, desechemos el supernat. Agregue 50 microlitros de un tampón de carga de páginas XSDS a la matriz de afinidad precipitada o al vórtice de resina de absorción y hierva durante 10 minutos a 80 a 100 grados Celsius en una centrífuga de bloque de calor.

La matriz de afinidad hervida es resina durante dos minutos a 10.000. GS alícuota cinco microlitros del supernat para el bloqueo inmunológico y se ejecuta con otras fracciones en una página SDS de 10 centímetros de largo. Gel para la separación e identificación de proteínas fosforiladas por espectrometría de masas.

Cargue los 45 microlitros restantes en una mancha de gel para páginas SDS. El gel de página SDS con brillo coloidal kamasi brillante. A continuación, detenga el gel con abundante lavado y agua, preferiblemente durante la noche.

Ahora, con un bisturí limpio, extirpe la banda de interés del gel, corte el gel en cubos de dos a cuatro milímetros y transfiera la muestra a un tubo. Lavar las piezas de gel con 50% de nitrilo aceto y 50 milimolares de bicarbonato de amonio hasta que se elimine la mancha. A continuación, pipetee la solución.

Teniendo cuidado de no quitar los pedazos de gel. Deshidratar la muestra con nitrilo aceto al 100% durante cinco minutos y retirar el líquido libre. Luego, para reducir los enlaces de sulfuro de proteína a 10 milimolares DTT e incubar durante 30 a 45 minutos a 56 grados centígrados con agitación, retire el líquido libre ahora para alalquilar los residuos de cisteína.

Agregue 55 milimolares de cloro acetamida durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Retire el líquido libre, luego lave las piezas de gel dos veces con nitrilo 50%Aceto durante 10 minutos. Retire el líquido libre.

Ahora deshidrata las piezas de gel con 100% aceto nitrilo durante cinco minutos y retira el líquido libre para el Tríptico Digest. Con 40 microlitros de solución de trabajo de tripsina, deje que las piezas de gel se rehidraten durante 10 minutos con suficiente tampón de digestión para cubrir las piezas de gel. Incubar a 37 grados centígrados durante la noche para detener la digestión y extraer los péptidos de las piezas de gel al 5% de sonitrato de ácido fórmico durante cinco a 10 minutos.

A continuación, transfiera el supernat a un nuevo tubo, seque los péptidos mediante liofilización o un concentrador de vacío y almacene las muestras a menos 20 grados centígrados. Este experimento purifica el complejo quinasa P-R-F-P-T-O de nacoa hamana, un nacoa hamana transgénico que expresa 35 SPTO se transformó transitoriamente con 35 bandera SPRF, y el complejo se inmunoprecipitó con Anti-Flag M dos aros. Las inmunotransferencias ilustran la inmunoprecipitación eficiente de la proteína PRF diana, tanto la PTO como la proteína efectora interactuante copurificada con PRF, según lo indicado por la detección de anticuerpos y el análisis de espectrometría de masas.

En este caso, la estrategia consistió en dirigirse a la proteína PTO con Anti-Flag. La estrategia cambió. Con el fin de identificar los sitios de fosforilación de PTO.

La cantidad total de proteína PTO que comprende tanto el complejo PRF como la forma libre se inmunoprecipitó con Anti-Flag M dos aros y se sometió a fraccionamiento de página SDS, digestión de tríptico ingel y análisis de espectrometría de masas, lo que dio como resultado péptidos PTO que abarcan aproximadamente el 80% de su secuencia. Curiosamente, se identificó un conjunto de sitios de fosforilación individuales para los péptidos PTO. Nótese que los sitios de fosforilación dobles se identificaron solo en presencia de cualquiera de las proteínas efectoras.

Es importante obtener cantidades suficientes de proteína vegetal para identificar los componentes de un complejo proteico y también detectar la modificación postraduccional de una proteína de interés. Recuerde que las modificaciones del mapeo, como la fosforilación, requieren una cantidad razonable de proteínas de la espectrometría de masas, por lo que al menos una banda tenue debería ser evidente en su gel siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como el I, se puede realizar la identificación de componentes complejos para responder a preguntas adicionales, como cómo la activación del complejo inmunitario conduce a la inmunidad funcional.

No olvide que trabajar con tampones orgánicos, bacterias y BBL de afeitar puede ser extremadamente peligroso, así que tome precauciones como usar guantes y abrigos regáticos.