ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

El objetivo general de este método optimizado de captura del interactoma de ARNm es aislar e identificar un proteoma unido a ARNm a partir de células vegetales. Este método se aplica a protoplastos del mesófilo foliar de arabidopsis thaliana, un tipo celular utilizado como herramienta versátil en diversos ensayos celulares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regulación postranscripcional de la expresión génica, como descubrir y comprender el papel de las proteínas de unión al ARNm en plantas.

La principal ventaja de esta técnica es que puede aislar e identificar un mensajero vegetal en un proteoma ligado directamente desde el entorno fisiológico. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la proteína ligada al ARN mensajero procedente de protoplastos mesofílicos de hoja de aribidopsis. Además, puede aplicarse a otros sistemas, como protoplastos u tejidos de otras plantas.

Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando notamos que se había aplicado con éxito a líneas celulares de levadura y de mamífero. Aísle los protoplastos del mesófilo de hoja de arabidopsis para dos muestras diferentes, como se describe en el protocolo escrito. Mantenga la muestra control, que no será entrecruzada con UV, o muestra no CL, sobre hielo.

Transfiera la suspensión de protoplastos que se va a reticular, o muestra CL, a una placa de Petri grande. Añada 30 mililitros de solución MMG fría con hielo a la placa para cubrir la superficie y distribuya las células mediante pipeteo suave. Cubra la placa de Petri con papel de aluminio cuando se transporte al aparato de reticulación por UV.

Coloque inmediatamente la placa de Petri abierta en un aparato de reticulación con UV. Asegúrese de que la distancia entre la placa y la lámpara de UV sea de ocho centímetros y luego irradie la muestra durante un minuto. Después, alícuote rápidamente la suspensión de protoplastos de la placa de Petri en dos nuevos tubos redondos de 50 mililitros.

Lave el fondo del recipiente con cinco mililitros adicionales de la solución MMG fría para recoger el resto de los protoplastos. Divida la suspensión entre los dos tubos. A continuación, centrifugue las muestras sin CL y las dos muestras con CL a 100 × g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Después de desechar el sobrenadante, coloque el tubo con el pellet no CL nuevamente en hielo. Añada 10 mililitros de solución MMG fría con hielo a cada tubo de muestra CL y agite suavemente los tubos para resuspender los pellets. Después de combinar las dos muestras en un solo tubo redondo de 50 mililitros, centrifugue a 100 veces g a cuatro grados celsius durante cinco minutos.

Después de desechar el sobrenadante, mantenga el precipitado en hielo. A continuación, agregue nueve mililitros de tampón de lisis y unión frío a hielo al precipitado celular de cada muestra. Lise los protoplastos pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente veinte veces, hasta que la solución adquiera un color verde claro homogéneo.

Para la homogeneización, pase el lisado de protoplastos dos veces a través de una jeringa de vidrio de 50 mililitros con una aguja estrecha y luego incube el lisado en hielo durante diez minutos. Congele las muestras en nitrógeno líquido y almacénelas a menos 80 grados celsius durante hasta tres semanas. Después de descongelar el tubo con lisado de protoplastos congelado a temperatura ambiente, mantenga el tubo en hielo.

Aliquotar 1,8 mililitros de perlas magnéticas de oligo-d(T) en seis nuevos tubos microcentrífugos redondos de dos mililitros colocados en hielo. Lavar la suspensión de perlas en cada tubo con 600 microlitros de tampón de lisis y unión pipeteando brevemente hacia arriba y hacia abajo y rotar suavemente las perlas en un rotador durante dos minutos. Mantener las perlas en hielo.

A continuación, coloque los seis tubos que contienen las perlas en un soporte magnético durante al menos tres minutos para permitir suficiente tiempo para la captura magnética completa. Cuando las perlas sean completamente capturadas, la suspensión se volverá transparente. Luego, deseche el sobrenadante de los seis tubos e inmediatamente alícuota nueve mililitros de lisado de protoplastos en ellos.

Mezcle las perlas con el lisado mediante pipeteo hasta que la suspensión se vea marrón y homogénea. Incube los tubos a cuatro grados celsius durante una hora con rotación suave. Después de la incubación, coloque los tubos nuevamente en el soporte magnético durante tres minutos.

Cuando todas las perlas estén capturadas en el lateral de los tubos, recoja el sobrenadante que contiene el lisado de protoplastos en seis nuevos tubos microcentrífugos redondos de dos mililitros. A continuación, agregue 1,5 mililitros de tampón de lavado frío uno a cada tubo que contenga perlas y resuspenda las perlas mediante pipeteo. Tras una rotación suave durante un minuto, coloque los tubos nuevamente en el soporte magnético durante tres minutos.

Deseche el sobrenadante y repita este paso de lavado una vez. Usando 1,5 mililitros de tampón de lavado frío dos, repita el mismo procedimiento de lavado dos veces. Si los mRNP se han aislado eficientemente del lisado de protoplastos, debería observarse un halo visible alrededor del pellet de perlas en la muestra CL.

Finalmente, repita el procedimiento de lavado una vez con 1,5 mililitros de tampón de bajo contenido salino frío con hielo. Después del lavado, agregue 500 microlitros de tampón de elución a cada tubo y re-suspenda suavemente las perlas mediante pipeteo. Incube a 50 grados centígrados durante tres minutos para liberar los ARN con cola poli-A.

Re-suspenda suavemente las perlas mediante pipeteo una sola vez y coloque los tubos nuevamente en el soporte magnético a cuatro grados celsius durante cinco minutos. Transfiera y combine los eluidos de los seis tubos en un tubo cónico de 15 mililitros colocado sobre hielo. Esto producirá aproximadamente tres milímetros del eluido.

La calidad y cantidad de ARN se pueden determinar inmediatamente utilizando un espectrofotómetro. Prepare las perlas de oligo-d(T) para reutilizarlas lavándolas dos veces con un mililitro de tampón de elución frío con hielo. Después de eso, lávelas con un mililitro de tampón de lisis y unión frío con hielo para ajustar nuevamente la concentración de sal a 500 milimolar.

Utilice estas perlas de oligo-d(T) lavadas para repetir los procedimientos de unión, lavado y elución durante otras dos rondas adicionales. Esto agotará el ARN con cola poli-A del lisado de protoplastos y producirá un total de nueve milímetros de eluyente para cada muestra. Las perlas pueden almacenarse y utilizarse para otro experimento un máximo de tres veces.

Para evaluar la calidad del ARN, digiera las proteínas cruzadas por UV con la solución de proteinasa K según el protocolo descrito. Luego, purifique el ARN utilizando el kit de purificación de ARN para eliminar cualquier contaminante residual. Tras la purificación, las muestras están listas para la prueba de calidad del ARN mediante qRT-PCR.

Comience tratando ocho mililitros de cada muestra con 100 unidades de una mezcla de RNasas que contiene RNasa A y RNasa T1. Después de una breve vortexación, incube las muestras a 37 grados Celsius durante una hora. Para concentrar las proteínas que se unen al ARNm, o mRBP, filtre las muestras utilizando unidades de filtro centrífugo. Cada muestra producirá 75 microlitros con dos microgramos de proteína.

Para el almacenamiento a largo plazo, congele las muestras a menos 80 grados Celsius. Para correr un gel de SDS-PAGE, mezcle 25 microlitros de cada muestra concentrada con 15 microlitros de colorante de carga 2X y caliente las muestras a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Cargue las muestras junto con un marcador de proteínas en un gel de SDS-PAGE con un gel de apilamiento al cinco por ciento y un gel de separación al doce por ciento.

A continuación, lave el gel dos veces con agua ultrapura durante cinco minutos por lavado. Utilice un kit comercial de tinción con plata para teñir el gel. Si se ha utilizado un número suficiente de protoplastos iniciales, las bandas proteicas aparecerán dentro de los cinco minutos.

Para realizar más pruebas con las mRBP, purifique los péptidos a partir de un segundo gel 1D según se explica en el protocolo escrito. Estos péptidos purificados ahora pueden analizarse mediante cromatografía líquida de fase reversa en nanoescala, espectrometría de masas, y proteómica cualitativa y cuantitativa. Tras la captura con perlas de oligo-d(T), la qRT-PCR demostró niveles significativamente más altos de ARNm de referencia de poliubiquitina 10 en comparación con el ARNr 18S.

Dado que las perlas de oligo-d(T) solo se unen al ARN con cola poli-A, esto sugiere que los ARNm están enriquecidos en el eluato. La captura de mRBP por las perlas de oligo-d(T) se evalúa además mediante una electroforesis SDS-PAGE teñida con plata. El gel muestra una cantidad significativamente mayor de proteína en la muestra CL con entrecruzamiento por UV en comparación con la muestra no CL sin entrecruzamiento.

La duración de la irradiación UV puede influir en la eficiencia del entrecruzamiento. Este gel SDS-PAGE teñido con plata confirma que uno o tres minutos de irradiación UV son la condición óptima, con las intensidades de banda más fuertes. Un total de 325 proteínas fueron identificadas mediante análisis proteómico cuantitativo.

225 de estas proteínas estuvieron por debajo del nivel de significancia debido a la presencia de péptidos poco abundantes para cada proteína, con alta variabilidad en las intensidades de los péptidos. Sin embargo, dado que todas ellas se detectaron cualitativamente únicamente en las muestras CL, se consideró que todos los resultados fueron positivos. Estas 325 proteínas se clasificaron además en tres categorías: proteínas ribosomales, principales RBP y RBP candidatas.

La falta de dominios de unión al ARN convencionales en las proteínas de unión al ARN candidatas y el hecho de que la mayoría de sus funciones no se hayan validado sugieren posibles funciones novedosas en la regulación del ARN. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una semana si se lleva a cabo adecuadamente. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las vías de regulación molecular en plantas exploraran el proteoma unido al ARN mensajero a nivel del genoma en células y tejidos de dicotiledóneas y monocotiledóneas.