Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la

El objetivo general de este procedimiento es incorporar genes gag derivados de individuos infectados con el subtipo C del VIH-1 en un plásmido de VIH-1 con capacidad de replicación, con el fin de evaluar el efecto de los polimorfismos en la secuencia de gag sobre la capacidad de replicación del VIH-1 in vitro. Esto se logra primero amplificando el gen gag a partir del plasma del paciente. El segundo paso consiste en clonar la secuencia de gag derivada del paciente en el clon molecular infeccioso y con capacidad de replicación MJ-four. A continuación, el plásmido quimérico gag-MJ-four se transfecta para generar partículas virales infecciosas, las cuales se titulan para evaluar su infectividad en una línea celular indicadora. El paso final consiste en medir la capacidad de replicación in vitro en la línea celular T GXR-25. En última instancia, se utiliza un ensayo de transcriptasa inversa marcada con radioisótopos para cuantificar la producción de viriones a lo largo del tiempo y así visualizar la cinética de replicación viral.

El método que vamos a describir hoy puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del VIH. Estas incluyen definir los determinantes del fitness replicativo del VIH y comprender cómo el fitness del VIH afecta la patogénesis a largo plazo. Describiendo los métodos hoy estarán Jessica Prince y Dan Claiborne, dos de mis estudiantes de posgrado.

Para comenzar este procedimiento, transcriba a la inversa el ADNc a partir de ARN y amplifique los productos de ADN de la primera ronda utilizando transcriptasa inversa y una ADN polimerasa termoestable en una RT-PCR en un solo paso. Luego, utilizando un microlitro de la amplificación por PCR de la primera ronda como molde de ADN, realice una amplificación por PCR anidada de segunda ronda. A continuación, agregue tres microlitros de colorante de carga 5X a cinco microlitros del volumen de reacción de la segunda ronda.

Correrlo a 120 voltios en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE que contenga un colorante fluorescente para ADN sensible a UV hasta que las bandas se separen. Luego, visualizar las bandas de 1,6 kb en un iluminador de luz azul. A continuación, correr el volumen restante de la reacción, de 45 microlitros, en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE que contenga el colorante para ADN. Recortar las bandas apropiadas con una cuchilla limpia y combinar tres reacciones positivas por individuo. Posteriormente, extraer el ADN del trozo de gel utilizando un kit de purificación de geles y eluirlo en agua libre de nucleasas. Congelar el producto a menos 20 grados Celsius para su uso posterior. 0:15:56 En este procedimiento, tras amplificar la región del extremo repetido largo (LTR) del extremo 5’ UTR del plásmido MJ-four, visualizar los productos de PCR de 1,3 kb en el iluminador. Recortar los amplicones positivos, luego purificarlos y congelarlos como se describió anteriormente. A continuación, crear los amplicones fusionados LTR-gag del MJ-four mediante PCR de extensión por traslape (SOE-PCR). Visualizar, recortar, purificar y congelar el amplicón largo de 3,2 kb. Ahora digerir 1,5 microgramos del plásmido MJ-four y 1,5 microgramos del producto de PCR purificado LTR-gag con la endonucleasa de restricción BCL-one durante 1,5 horas a 50 grados Celsius. Posteriormente, añadir un microlitro de NGOM-four a la reacción de digestión e incubarla a 37 grados Celsius durante una hora. Después, añadir colorante de carga 5x a las reacciones de digestión con enzimas de restricción. Realizar lentamente la electroforesis del volumen total en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE que contenga un colorante para ADN, durante una a dos horas a 100 voltios. Visualizar, recortar y purificar las bandas indicadas para clonación como se describió previamente.

A continuación, prepare las reacciones de ligación utilizando el inserto purificado de LTR-gag y ADN del vector MJ-four en una proporción de tres a uno de inserto respecto al vector. Incube las reacciones de ligación durante la noche a cuatro grados Celsius.

Luego, transforme bacterias JM-109 químicamente competentes con los productos de ligación y siémbrelos en placas de agar LB con 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Cultive las bacterias transformadas a 30 grados Celsius durante al menos 22 horas. Para confirmar la fidelidad del clonado, corte el ADN de mini prep con las enzimas de restricción NGOM-four y HPA-one en un doble digestión a 37 grados Celsius durante dos horas.

Posteriormente, analícelo en un gel de agarosa TAE al 1%. Calcule el volumen de virus necesario de cada stock en función del título en UI por microlitro obtenido mediante un ensayo en células TZM-BL, con el fin de infectar cinco veces 10 a la quinta células GXR-25 a una multiplicidad de infección de 0,05. Asegúrese de usar el equipo de protección personal adecuado para trabajar con VIH con capacidad de replicación, que incluye bata completa, mascarilla facial y doble guante. El día de la infección, retire los stocks de virus del congelador a menos 80 grados Celsius y deshiélelos. A continuación, diluya el virus en medio C-R-P-M-I hasta un volumen de 100 microlitros, para alcanzar un MOI de 0,05. Agréguelo a la placa de cultivo celular de 96 pocillos con fondo en V, incluyendo tanto un control positivo como un control negativo en cada serie de experimentos de replicación, y prepare la placa de manera que cada dos columnas estén vacías para limitar la contaminación cruzada entre los pocillos. Posteriormente, cuente las células GXR-25 utilizando un contador celular automatizado y calcule el número total de células necesarias para todas las infecciones. Aliquote el volumen requerido en un tubo cónico de 50 mililitros y centrifugue para obtener el pellet celular. Luego aspire cuidadosamente el medio y resuspenda en C-R-P-M-I a una concentración de cinco veces 10 a la quinta células por 100 microlitros. Transfiera las células con una pipeta a una cubeta estéril y mezcle bien. Posteriormente, utilizando una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de células a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contenga el virus diluido y mezcle completamente. Después, añada dos microlitros de una solución de polibreno a cinco miligramos por mililitro a cada pocillo y mezcle bien las células. A continuación, incube a 37 grados Celsius en una incubadora de cultivo celular con 5% de CO2 durante tres horas.

Para lavar las células infectadas, centrifugue la placa de 96 pocillos en forma de V para sedimentar las células. Luego, retire cuidadosamente 150 microlitros del medio y sustitúyalo por 150 microlitros frescos de C-R-P-M-I sin perturbar el sedimento celular. Repita el procedimiento dos veces más para lavar adecuadamente las células. Después de la última centrifugación y la adición de 150 microlitros de C-R-P-M-I, resuspenda el sedimento celular con una pipeta multicanal. Añada la mezcla de cada pocillo a 800 microlitros de C-R-P-M-I en un pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. A continuación, coloque la placa en un incubador de cultivo celular con 5% de CO₂ a 37 grados Celsius. Cada dos días, transfiera 100 microlitros de sobrenadante desde la superficie del pocillo de cultivo a un pocillo de una placa de 96 pocillos en forma de U y congélelos para su posterior análisis mediante el ensayo de RT. Luego, resuspenda completamente las células y retire la mitad del volumen restante para evitar el sobrecrecimiento celular. A continuación, restablezca el volumen original añadiendo 550 microlitros de C-R-P-M-I fresco a cada pocillo.

En este procedimiento, agregue uno a dos microlitros de DTTP de 10 milicurios por mililitro y cuatro microlitros de DTT uno molar a cada alícuota de un mililitro de la mezcla maestra de RT. Mezcle cuidadosamente cada tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros de mezcla maestra de RT, DTT y DTTP con una pipeta de 1000 microlitros y transfiera a una cubeta estéril.

A continuación, distribuya 25 microlitros de la mezcla de RT marcada en cada pocillo de una placa PCR de 96 pocillos con paredes delgadas. Añada cinco microlitros de cada sobrenadante a la placa PCR que contiene la mezcla maestra de RT. Luego selle la placa PCR con una cubierta de lámina adhesiva e incube durante dos horas a 37 grados Celsius en un termociclador. Tras la incubación, haga pequeños orificios en la cubierta de lámina usando una pipeta multicanal de 200 microlitros. Mezcle las muestras cinco veces. Transfiera cinco microlitros de cada muestra a papel DE-81 y deje secar al aire todas las muestras durante 10 minutos. Coloque las tiras en recipientes de lavado separados. Posteriormente, lave las tiras cinco veces con SSC 1X. A continuación, lávelas dos veces con etanol al 90 % durante cinco minutos por cada lavado antes de dejarlas secar al aire. Una vez secas, envuelva cuidadosamente la tira en papel plástico transparente y expóngala a la pantalla fosforescente en una caja hermética durante toda la noche a temperatura ambiente.

Una vez listo, analice las pantallas fosfo con un imagenador de fósforo y cuantifique los transcritos radiactivos.

Se muestran aquí imágenes representativas de geles que ilustran la separación electroforética de los diversos amplicones PCR necesarios para generar un amplicón de gag derivado de paciente, capaz de clonarse en el vector plasmídico MJ-four. Esta imagen representativa de gel muestra la separación electroforética de digestiones con enzimas de restricción para la clonación de genes gag de pacientes en MJ four.

Y esta imagen representativa de un gel muestra la separación electroforética de digestiones con enzimas de restricción de un ADN plasmídico purificado del quimera gag MJ-cuatro. Este gráfico muestra la reproducibilidad del ensayo de replicación a lo largo del tiempo en la línea celular GXR-25. Se utilizaron los mismos virus quiméricos gag MJ-cuatro para infectar células GXR-25 en dos experimentos independientes realizados aproximadamente con un año de diferencia.

Los puntajes de replicación se generaron calculando la pendiente de los valores de DLU transformados logarítmicamente y normalizando dicha pendiente respecto al tipo silvestre MJ-four. Las dos mediciones independientes están fuertemente correlacionadas y resaltan la reproducibilidad de los ensayos realizados en diferentes momentos y con células en distintos pasajes. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del VIH/sida exploren los determinantes virales de la patogénesis, en la infección aguda por subtipo C, el subtipo más prevalente en el mundo. Trabajar con VIH con capacidad de replicación puede ser extremadamente peligroso. Todos los pasos que involucren virus vivos deben realizarse en una instalación BSL dos más. Todas las superficies deben descontaminarse regularmente y debe usarse doble guante en todo momento.