Cromosomas artificiales bacterianos: una herramienta de Genómica Funcional para el Estudio de cadena positiva virus de ARN

El objetivo general de este procedimiento es recuperar partículas de virus infecciosos producidas completamente a partir de un cDNA clonado de virus de ARN de cadena positiva, cuyos genomas presentan la misma polaridad que el ARNm celular, como el virus de la encefalitis japonesa. Esta genética inversa basada en cDNA es un método fundamental que permite la manipulación directa del ARN genómico viral, generando así virus recombinantes para el estudio molecular y genético de la replicación y la patogénesis virales. Esta técnica también proporciona una plataforma valiosa que permite el desarrollo de vectores virales del virus vaccinia genéticamente definidos para la entrega de genes foráneos.

Estos métodos son aplicables para la clonación de ADNc de longitud completa de virus de ARN de cadena negativa o positiva, particularmente aquellos con genomas mayores de 10 kb. Demostrando el procedimiento estarán varios miembros de mi laboratorio: la asistente de investigación Sang-Im Yun, los becarios postdoctorales Byung-Hak Song y Jin-Kyoung Kim, y el estudiante de pregrado Jordan Frank.

La parte del video de esta publicación abarca la preparación del cromosoma bacteriano artificial que contiene las secuencias de interés, la síntesis de ARN transcrito a partir del plásmido inverso y cómo medir la infectividad del ARN y el rendimiento del virus. Todos los procedimientos utilizados antes de generar el plásmido BAC se proporcionan en el protocolo escrito con gran detalle. Para este procedimiento, primero cultive una colonia individual de E. coli DH10B, que porta el plásmido BAC, en tres mililitros de caldo 2X YT con cloranfenicol. Incube el cultivo durante 10 horas a 35 grados Celsius con agitación a 225-250 rpm.

Después de 10 horas, aumente la escala del cultivo. A continuación, inocule 500 microlitros de crecimiento en 500 mililitros de medio y cultive el inóculo durante seis horas con agitación vigorosa. Después de seis horas, centrifugue el cultivo bacteriano en 2 botellas de 250 mililitros a 3.100 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, re suspenda cada pellet en 30 mililitros de solución GTE.

Añada 500 microlitros de lisozima e incube las suspensiones en hielo durante 10 minutos. Mientras tanto, prepare una solución de lisis fresca para el siguiente paso. Después de 10 minutos, añada 60 mililitros de la solución de lisis y mezcle girando suavemente hasta que la solución aparezca clara.

Deje que las reacciones transcurran a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, agregue 45 mililitros de solución neutralizante a cada frasco e inviértalos hasta que estén completamente mezclados. Luego, colóquelos en hielo durante 10 minutos.

Recolecte los lisados neutralizados mediante centrifugación refrigerada a alta velocidad. Luego, recoja los sobrenadantes en dos nuevos frascos de 250 mililitros. Añada 0,6 volúmenes de isopropanol al 100 % a cada uno y colóquelos en hielo durante 20 minutos.

A continuación, centrifugue los precipitados, deseche los sobrenadantes y disuelva los pellet en cinco mililitros de tampón TE. Combine los dos volúmenes en un solo tubo de 50 mililitros y precipite el ARN añadiendo un volumen igual de cloruro de litio 5 M e incubando la mezcla en hielo durante 10 minutos. Utilice una centrifugación fría de 20 minutos para recoger el precipitado de ARN.

Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 250 mililitros, agregue dos volúmenes de isopropanol al 100 % y coloque el tubo en hielo para que se forme el precipitado de ADN. Después de 20 minutos, centrifugue para sedimentar el precipitado, aspire el sobrenadante, re suspenda el botón de ADN en 9,5 mililitros de tampón TE y transfiera la solución de ADN a un tubo de 50 mililitros.

Continúe la preparación estableciendo el gradiente de cloruro de cesio con bromuro de etidio. Cargue la mezcla en un tubo de polipropileno sellable utilizando una jeringa con una aguja de calibre 18 y selle el tubo. Gire el tubo sellado durante la noche en una ultracentrífuga para formar un gradiente de cloruro de cesio.

Al día siguiente, recolecte una banda de ADN del plásmido BAC a partir del gradiente de cloruro de cesio. Utilice una aguja de calibre 18 para crear una ventilación de aire en la parte superior del gradiente y una aguja de calibre 20 con jeringa para recolectar el ADN BAC desde el lateral del gradiente, y luego transfiera la recolección a un tubo microcentrífugo de 1,7 mililitros. Realice un lavado, agregue 2,5 volúmenes de butanol saturado con agua y mezcle mediante vortexado normal.

Luego, centrifugue la mezcla a temperatura ambiente y transfiera la fase acuosa inferior a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,7 mililitros. Repita este lavado un total de seis veces para eliminar todo el bromuro de etidio. Ahora, precipite el ADN BAC. Agregue un décimo de volumen de acetato de sodio tres molar y 2,5 volúmenes de etanol al 100% al tubo. Incube la mezcla en hielo durante 10 minutos. Luego, centrifugue el precipitado a temperatura ambiente y lave el botón de ADN con un mililitro de etanol al 70%. Repita la centrifugación y recupere el botón nuevamente. Finalmente, seque al aire el ADN en botón durante 10 minutos y elúyalo en 200 microlitros de tampón TE.

Comience con una digestión a gran escala con enzima de restricción del plásmido BAC con Xba-uno en un volumen total de 100 microlitros. Realice esta digestión a 37 grados Celsius durante 12 a 15 horas. A continuación, incube adicionalmente la digestión con 25 unidades adicionales de nucelasa de frijol mungo a 30 grados Celsius durante dos horas.

Después de la incubación, aforar el volumen hasta 300 microlitros con agua destilada. A continuación, realice una extracción con fenol agregando un volumen igual de fenol-cloroformo, alcohol isoamílico a la muestra diluida, vortexeando vigorosamente durante un minuto, centrifugando el tubo y transfiriendo la fase acuosa superior a un tubo nuevo.

A continuación, repita la extracción con cloroformo. Luego, recupere el ADN de BAC linealizado mediante precipitación con etanol. Recoja el pellet de ADN por centrifugación, deseche el sobrenadante y lave el pellet con un mililitro de etanol al 70 %. Repita el paso de centrifugación y seque el pellet al aire. Tras 10 minutos de secado, disuelva el pellet de ADN en 30 microlitros de agua destilada. A continuación, analice un microlitro del BAC recuperado en un gel de agarosa al 0,8 %.

A continuación, prepare una transcripción por runoff de 25 microlitros del ADN del BAC linealizado, incluyendo UTP tritiado para la cuantificación de ARN. Realice la reacción a 37 grados Celsius durante una hora. Luego, examine uno o dos microlitros de la reacción de transcripción por runoff en un gel de agarosa al 0,6 %.

Comience con células BHK-21 cultivadas durante 24 horas en placas de 150 milímetros sembradas a 3 millones de células por placa. Lave la monocapa celular con la solución fría A y luego desprenda las células mediante tripsinización. Recopile las células por centrifugación a 270 g durante dos minutos.

Luego, resuspenda las células en 50 mililitros de la solución fría A y vuélvalas a centrifugar. Repita este lavado tres veces. Después del último lavado, resuspenda las células a 20 millones por mililitro en la solución A. A continuación, mezcle una alícuota de 400 microlitros de la suspensión celular con dos microgramos de ARN sintético en una cubeta de dos milímetros.

Electroporar inmediatamente la mezcla en condiciones óptimas y dejar reposar las células durante 10 minutos. A continuación, transferir las células a un tubo microcéntrifugo que contenga 600 microlitros de medio de cultivo completo. Preparar ahora diluciones seriadas de diez veces de las células electroporadas en volúmenes de un mililitro. Sembrar alícuotas de 100 microlitros de cada dilución sobre monocapas de células BHK21 normales. Tras cuatro a seis horas de incubación, cubrir las células con agarosa al 0,5 % en MEM más suero bovino fetal (FBS) y cultivarlas durante cuatro días más.

Las células BHK21 fueron sometidas a electro poración simulada o electro poradas con transcritos de ARN derivados de dos clones independientes del JEV-BAC de longitud completa. Cuatro días después, las células fueron teñidas con violeta de cristal para observar el ARN infeccioso en las células. Mediante esta tinción, se cuantificaron los centros infecciosos. A continuación, se examinó la expresión de proteínas virales en células electro poradas con ARN 20 horas después de la transfección, utilizando un antisuero de conejo anti-NS1 y un anticuerpo secundario conjugado con Cy3, visible en rojo. Los núcleos fueron contrateñidos con DAPI, visible en azul. Posteriormente, a las 22 y 40 horas tras la transfección, se analizó la producción de viriones infecciosos acumulados en los sobrenadantes de cultivo de las células electro poradas con ARN mediante ensayos de placas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recuperar un virus infeccioso completamente a partir de un ADNc clonado de una cepa positiva de ARN, como el virus de la encefalitis japonesa. Así que no olvide que trabajar con el virus de la encefalitis japonesa y otros patógenos humanos puede ser extremadamente peligroso. Es necesario contar con una formación adecuada en bioseguridad antes de realizar este procedimiento.