Análisis Integral de Transcripción Dinámica del cerebro muestras Siguiendo Experiencia del Comportamiento

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar la dinámica transcripcional y los núcleos cerebrales definidos de ratones después de la experiencia conductual. Esto se logra habituando primero a los animales y registrando su actividad locomotora después de la inyección de solución salina. Una vez habituado, la actividad locomotora se registra después de una dosis única de cocaína, luego se recolectan muestras del núcleo accumbens y se utilizan para el aislamiento de ARN y la preparación de CDNA.

A continuación, se realiza un análisis de QPCR con el fin de estudiar la expresión génica inducida por el comportamiento. Finalmente, se obtienen resultados que muestran la dinámica transcripcional después de la experiencia con cocaína Demostrando el protocolo estarán el Dr. Hatu, el gerente del laboratorio, Dum Muer, un estudiante graduado del laboratorio y Duran un estudiante de pregrado del laboratorio durante tres días consecutivos. Cada ratón está habituado a los procedimientos de manipulación e inyección, organizando a los ratones en jaulas antes de iniciar el experimento, de modo que los ratones no serán transferidos entre jaulas en el futuro y los ratones nunca se dejarán aislados durante un período prolongado de tiempo.

30 minutos antes del inicio de las pruebas, todas las jaulas de prueba deben transferirse a la sala de comportamiento para permitir que los animales se aclimaten al entorno. Administrar una inyección intraperitoneal de 250 microlitros de solución salina inmediatamente después de la inyección, colocar al ratón en una cámara de comportamiento para monitorizar la actividad locomotora durante 15 minutos. El ratón se puede colocar en la cámara de comportamiento durante 20 minutos.

Una actividad monitorizada desde el minuto dos hasta el 17. Repita estos pasos a la misma hora del día durante los dos días siguientes. Al cuarto día, administrar una sola inyección de cocaína o solución salina, dependiendo del grupo, e inmediatamente colocar el ratón en la cámara para monitorear la actividad motora local durante 20 minutos en puntos de tiempo seleccionados después de la exposición a la cocaína, extraer el cerebro y colocarlo en hielo, una solución de líquido cefalorraquídeo durante uno o dos minutos para que se enfríe y endurezca.

Después de eliminar el cerebelo y absorber el exceso de líquido, pega el cerebro a la etapa de vibram con la parte rostral hacia arriba. Llene la cámara con líquido cefalorraquídeo A frío y corte secciones de 200 micras hasta que el núcleo accumbens esté claramente identificado. Preste mucha atención a la forma del cuerpo calloso, la ubicación y la forma de la comisura anterior y los ventrículos mientras corta.

Una vez identificada la región correcta, se cortan dos secciones de 400 micras a partir de las cuales se diseccionará el núcleo accumbens bajo un estereoscopio. Use una cuchilla fina para diseccionar el núcleo accumbens lejos de las rodajas. Cuatro pasadas rápidas de la cuchilla en el área correcta deberían aislar el tejido apropiado de inmediato.

Coloque el tejido aislado en 900 microlitros de reactivo de lisis y almacene a menos 80 grados Celsius hasta que comience la extracción de ARN para comenzar a descongelar los tubos a 37 grados Celsius y homogeneizar. Con una aguja de calibre 25, las primeras rondas pueden ser difíciles y requerir empujar el tejido contra la pared del tubo para homogeneizarlo en pedazos pequeños. Para garantizar una homogeneización adecuada, pipetee el lisado en una mini columna de centrifugación y centrífuga de la trituradora de kaya.

Pipetear el lisado en un nuevo tubo de microcentrífuga y extraer el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la purificación del ARN, se realiza la transcripción inversa a CDNA, así como la amplificación de preem específica de las muestras con cebadores dirigidos contra el grupo de genes elegidos para el análisis. Estos procedimientos se describen en la versión de texto del protocolo.

Los chips microfluídicos comerciales para el análisis QPCR completo están disponibles en 48 por 48. Formato, que permite el análisis de 48 muestras con 48 juegos de sondas, o en un formato de 96 por 96 en el que se analizan 96 muestras con 96 sondas. En la mayoría de los casos, la elección del chip depende principalmente del número de muestras analizadas.

Primero, prepare la mezcla de muestra de acuerdo con el chip elegido para el experimento. Tenga cuidado al pipetear el reactivo de carga de muestras de colorante de unión a 20 XDNA. Agite las soluciones de mezcla de muestra durante un mínimo de 20 segundos y centrifugue durante al menos 30 segundos.

Las reacciones preparadas se pueden almacenar durante períodos cortos a cuatro grados centígrados hasta que el chip esté listo para cargarse. A continuación, prepare la mezcla de ensayo, agite bien la mezcla de muestra y centrifuga para centrifugar todos los componentes. Como se mostró anteriormente, el chip IFC de matriz dinámica tiene entradas para muestras y ensayos, así como entradas especificadas para el fluido de la línea de control utilizado para presurizar las cámaras microfluídicas.

Primero, inyecte líquido de línea de control en cada acumulador del chip. A continuación, cebe el chip colocándolo en el controlador IFC y ejecutando el script adecuado. Una vez finalizado el script, retire el chip cebado del controlador IFC y pipetee cinco microlitros de cada ensayo.

Mezcle sobre la papa frita. Agregue cinco microlitros de cada mezcla de muestra en sus entradas y devuelva el chip al controlador IFC utilizando el software del controlador IFC. Ejecute el script para cargar las muestras y los ensayos en el chip.

Cuando el script de mezcla de carga haya finalizado, retire el chip cargado del controlador IFC. A continuación, cargue el chip en el termociclador y cree una nueva ejecución de chip que incluya un análisis de la curva de fusión. El uso del software del termociclador garantiza que las cámaras de reacción se reconozcan correctamente y permitan que la reacción se desarrolle hasta su finalización.

Un aumento en la actividad locomotora fue evidente después de una sola inyección aguda de cocaína. En esta sección coronal, gruesas líneas blancas marcaban la ubicación de los cortes realizados para definir los límites del núcleo accumbens. Durante la disección, las curvas de amplificación de los cebadores dirigidas contra los CFO y phos B demuestran que los pares de cebadores amplifican su transcripción objetivo con una eficiencia aproximada del 100%.

En cada ciclo, los resultados muestran que la expresión inducida por la cocaína de CFOs y phos B en el núcleo accumbens fue mayor una y dos horas después de la exposición. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación de nueva generación, para identificar nuevas transcripciones no caracterizadas.